Post-enfeksiyöz üveiti incelemek için astarlanmış mikobakteriyel üveitin bir murin modeli

Özet

Kaynak: John, S., et al. Post-enfeksiyöz üveit için bir model olarak mikobakteriyel üveit (PMU). J. Vis. Uzm. (2021).

Bu video, bulaşıcı sonrası üveiti incelemek için hazırlanmış mikobakteriyel üveitin (PMU) bir fare modelini oluşturma yöntemini gösterir. Daha önce aynı immünojen ile aşılanmış bir farede ısıyla öldürülmüş Mycobacterium tuberculosis'in intravitreal enjeksiyonu ile PMU'nun indüksiyonu üzerine, gözdeki kronik inflamasyonun ilerlemesi görüntüleme ve histopatolojik inceleme kullanılarak analiz edilir

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

>1. Deri altı enjeksiyon için antijen preparasyonu

1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) H37Ra tozunun solunmasını veya cilt temasını önlemek için bu bölümdeki tüm prosedürleri kimyasal bir çeker ocak içinde gerçekleştirin. Complete Freund's Adjuvant (tipik olarak BSL-1) için kurumsal politikalarınıza göre ele alın. Bu, kimyasallara dayanıklı eldivenler, koruyucu gözlükler ve koruyucu iş kıyafetleri (laboratuvar önlüğü) kullanmayı içerir.
2. Deney hayvanlarına verilecek reaktiflerin kontaminasyonunu önlemek için iyi bir steril teknik kullanın.
3. 5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 5 mg liyofilize, ısıyla öldürülmüş Mtb H37Ra tozunu 2,5 mL soğuk PBS ile karıştırarak fosfat tamponlu salin (PBS) içinde Mtb süspansiyonunu yapın. 30 saniye boyunca bir kez girdap yapın ve ardından buzun üzerine yerleştirin.
4. PBS'de H37Ra'nın ince bir süspansiyonunu oluşturmak için, süspansiyonu 5 dakika boyunca buz üzerinde sonikasyon yapın.
   1. Dönüştürücü ünitesinin gövdesini açınamp ve probu %70 (h/h) alkollü çubukla temizleyin.
   2. Sonikatörü açın, güç kontrol düğmesini çevirerek güç ayarını 4'e ayarlayın ve probun ucunu PBS içeren mikobakteriyel toza daldırın. Prob ucunun numunenin derinliğinin en az yarısına kadar daldırıldığından ve prob ucunun mikrosantrifüj tüpünün duvarına temas etmediğinden emin olun.
5. Karışımı 30 saniye boyunca buz üzerinde sonikasyona tabi tutun, 30 saniye duraklayın ve sıvıyı ısıtmadan tozu eşit bir süspansiyona tamamen dağıtmak için toplam 5 dakika tekrarlayın.
6. Karışıma 2.5 mL Freund'un Eksik Adjuvanı ekleyin ve emülsiyon diş macunu benzeri bir kıvam oluşturana kadar buz üzerinde sonikasyon işlemini tekrarlayın.
7. Kontrol düğmesini kullanarak gücü 0'a ayarlayın ve sonikasyonu sonlandırmak için üniteyi kapatın. Ucu süspansiyondan çıkarın ve probu alkollü bir bezle silin.
8. Antijen emülsiyonunu 4 °C'de saklayın. Emülsiyonun partilerini yapmak, deneyler arasında tutarlılığın sağlanmasına yardımcı olacaktır. Emülsiyon 4 °C'de 3 aya kadar saklanabilir.

2. Deri altı enjeksiyon

1. İntravitreal (IVT) enjeksiyondan bir hafta önce deri altı enjeksiyonu yapın (-7. gün olarak belirlenmiştir).
2. Mikobakteriyel emülsiyonu ile 1 mL'lik bir şırınga (iğne takılı değil) yükleyin. Emülsiyonun viskozitesi ve opaklığı nedeniyle, görülmesi zor hava kabarcıkları şırıngayı doldurabilir.
   1. Şırıngadaki hava kabarcıklarını önlemek için, 0.2-0.3 mL emülsiyon yükledikten sonra, şırıngayı ters çevirin (ucu yukarı bakacak şekilde) ve kabarcıkları yüzeye çıkarmak için şırıngayı bir tezgahın kenarına tekrar tekrar hafifçe vurun.
3. Şırıngadaki havayı boşaltın ve şırıngayı doldurmaya devam edin. Ters çevirin ve dolana kadar aralıklı olarak hafifçe vurun.
4. Şırınganın üzerine 25 G'lik bir iğne yerleştirin ve iğneyi doldurmak için emülsiyonu ilerletin. Şırıngayı kullanılana kadar buz üzerinde saklayın.
5. Deri altı enjeksiyonu güvenli bir şekilde gerçekleştirmek için, fareyi uyuşturun veya hayvanın arka kısmına kolay erişim sağlayan insancıl kısıtlama yöntemlerini kullanın.
6. Deri altı enjeksiyon için anestezi yapmak için, hayvanı bir izofluran indüksiyon odasına yerleştirin (indüksiyon için% 3 -% 4 ve% 1 -% 3). Anestezi uygulandıktan sonra, farenin yavaş bir solunum hızına sahip olduğundan ve solunum sıkıntısı belirtisi göstermediğinden emin olun.
7. Deri altı enjeksiyonları ya kalçaların dorsal yüzeyine ya da kasık lenf düğümlerinin bölgesine proksimal, bacakların ventral yüzeyine yerleştirin.
   1. Kas içine enjekte edilmesini önlemek için iğneyi dikkatlice yerleştirin. Deri altı boşluğa 0.05 mL Mtb emülsiyonu enjekte edin. Kalın emülsiyonun tam olarak enjekte edilmesini sağlamak için iğneyi hemen çıkarmayın.
   2. Hayvan başına toplam 0.1 mL olacak şekilde enjeksiyonu hem sol hem de sağ tarafta tekrarlayın.
8. Anestezi uygulanırsa, tamamen iyileşene kadar fareyi ılık bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin. Sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar fareyi gözetimsiz bırakmayın.
9. Tamamen iyileştikten sonra fareyi kafesine geri koyun ve kafes kartını deri altı enjeksiyon tarihi ile etiketleyin.
10. Oral asetaminofen (200 mg / kg / gün) ile analjezi sağlayın, ancak anti-enflamatuar ajanlar üveit indüksiyonunu etkileyebileceğinden steroid olmayan antienflamatuar ilaçlar (NSAID'ler) sağlamayın.

3. İntravitreal enjeksiyon için antijen stoğu hazırlama

1. İntravitreal Mtb süspansiyonunun kontaminasyonunu önlemek için bu bölümdeki tüm prosedürleri uygun steril koşullar altında gerçekleştirin.
2. İntravitreal süspansiyonları yapın.
   1. Hafif ila orta şiddette panüveit indüksiyonu için, 1 mL 1x PBS'ye 5 mg mikobakteri özü ekleyerek intravitreal süspansiyonu 5 mg / mL konsantrasyonda yapın.
   2. Orta ila şiddetli panüveit indüksiyonu için, 1 mL 1x PBS'ye 10 mg mikobakteri özütü ekleyerek intravitreal süspansiyonu 10 mg / mL konsantrasyonda yapın.
3. 30 saniye boyunca bir kez girdap yapın ve ardından buzun üzerine yerleştirin.
4. PBS'de H37Ra'nın ince bir süspansiyonunu oluşturmak için, süspansiyonu adım 1.4'te açıklandığı gibi 10 dakika boyunca buz üzerinde sonikasyon yapın. Bu stok çözeltisini 100 μL'lik hacimlerde alın ve -20 ° C'de saklayın.
5. Kullanmadan önce oda sıcaklığında çözdürün ve 1 dakika yüksekte girdap yapın. Alikotları hayvan tesisine taşırken buz üzerinde tutun.

>4. 0. günde intravitreal enjeksiyon prosedürü

1. Hayvan hazırlama
   1. Takılı muayene eldivenleri giyin ve ağırlığını gram cinsinden elde etmek için fareyi bir tartı terazisine yerleştirin.
   2. Hayvanı uyuşturmak için steril su ile karıştırılmış 100 mg / mL Ketamin ve 20 mg / mL Ksilazin içeren bir çözeltinin 0.02 mL / g vücut ağırlığının intraperitoneal enjeksiyonunu yapın. Alternatif bir yaklaşım, ~% 1.5 izofluran (solunan) kullanılarak indüksiyonu içerir.
   3. Farenin uyku moduna geçmesi için yaklaşık 2 dakika bekleyin ve ardından fareyi bir ısıtma kutusuna koyun ve kapağını kapatın. İşlem için anestezi derinliğini değerlendirmek için kulak, ayak parmağı ve kuyruk tutamağı gibi ağrı refleks testleri yapın.
   4. Uyuduktan sonra korneayı 1 damla %0,5 (h/h) tetrakain ile uyuşturun. Farenin burnuna veya ağzına yakın tetrakain almaktan kaçının. 10 saniye sonra fazla sıvıyı kurutun.
      not: Topikal anestezi uygulandığında, muhtemelen kombine sistemik ve topikal anestezi ile kornea refleks baskılanmasının iyileşmesine bağlı olarak, iris genişlemesi ve ön kamara (AC) görselleştirmesinin iyileştiği gözlenmiştir. Ancak, istenirse bu adım atlanabilir.
   5. Öğrenciyi 1 damla% 2.5 (h / h) fenilefrin ile genişletin. Burun veya ağza girebilecek fazla damlacıkları önlemek için dikkatli olun. 2-3 dakika sonra fazla sıvıyı alın.
   6. Endoftalmi riskini azaltmak için göz yüzeyine ve çevresindeki saça 1 damla %5 betadin ekleyin. Gözde 2-3 dk.
      bekletin. not: Endoftalmiyi önlemek için bu bölümdeki tüm prosedürleri uygun steril koşullar altında gerçekleştirin.
   7. Anestezi altında kuruluğu önlemek için betadini çıkarın ve gözü hipromelloz (% 0.3) veya karbomer göz jeli % 0.2 w/a) ile kapatın. Bu aynı zamanda katarakt oluşumunu önlemeye de yardımcı olacaktır.
2. Mikroenjeksiyon sisteminin kurulması
   1. Bir mikroşırınga pompası kontrolörüne bağlı bir mikro pompa ve bir enjeksiyon şırıngası kullanarak intravitreal enjeksiyonu gerçekleştirin (Şekil 1A-C). Alternatif olarak, alt bölüm 4.4'te açıklandığı gibi bir Hamilton şırıngasına bağlı 33 G'lik bir iğne ile enjekte edin.
   2. Enjektörü monte etmek için enjeksiyon tutucuya 34 G'lik bir iğne bağlayın. Enjeksiyon tutucunun ön ucundaki gümüş vidalı kapağı gevşetin ve iğneyi tutucunun gövdesine yaklaşık yarıya kadar kaydırın. Gümüş vidalı kapağı parmağınızla sıkın.
   3. Hortumu 4.2.4-4.2.5 adımlarında belirtildiği gibi enjeksiyon tutucuya bağlayın.
   4. Boruyu enjeksiyon tutucuya takmak için, tutucunun arka ucundaki plastik vidayı gevşetin, boruyu içerideki contadan kaydırın ve vidayı sıkın.
   5. Enjeksiyon sırasında borunun hasar görmesini önlemek için borunun ucuyla hafif bir boşluk bırakın. Şekil 1C'ye bakın.
   6. Mikobakteri stok süspansiyonunun 100 μL'lik bir alikotunu çözün.
   7. 3 μL% 1'lik bir floresein sodyum (AK-Fluor) çözeltisi ekleyin ve iyice girdaplayın.
   8. 10 μL'lik bir şırıngaya herhangi bir hava kabarcığı eklemeden antijen ve floresein karışımı yükleyin.
   9. Yükleme iğnesini şırıngadan çıkarın ve uç şırınga gövdesindeki sıfır işaretine ulaşana kadar boruyu gümüş vidalı kapak contasından kaydırın.
   10. Borunun ucu istenen konuma doğru şekilde hizalandıktan sonra, vidalı kapağı parmakla sıkın.
   11. Sistemi tam olarak yüklemek için şırıngadaki çözeltiyi enjeksiyon tüpünden yıkayın. Ardından, şırıngayı enjeksiyon için yeniden doldurmak için 4.2.8-4.2.11 adımlarını tekrarlayın.
   12. Yüklenen şırıngayı mikro pompaya takmak için, şırınga kelepçelerini açmak için mikro pompanın ucundaki kelepçe serbest bırakma düğmesine basın.
   13. Pistonun kapağını mikro pompanın arka ucundaki piston kapağı tutucusuna yerleştirin.
   14. Ardından şırınga bileziğini yaka durdurucusuna ve şırınga gövdesini şırınga kelepçesine kaydırın.
   15. cl'yi serbest bırakınamp düğmesine basın ve piston tespit vidasını sıkın. Şekil 1D'ye bakın.
   16. Enjeksiyon tutucuyu ve iğneyi stereotaktik enjeksiyon aparatı üzerindeki o-kelepçeden kaydırın. Bu özel bir platformdur; Alternatif olarak, şırınga manuel olarak tutulabilir ve konumlandırılabilir.
   17. Mikro şırınga pompası kontrol cihazındaki infüzyon hacmini ve infüzyon hacmi hızını, sırasıyla 40 nL/s hızında döngü başına 500 nL enjekte edecek şekilde ayarlayın.
       not: Daha hızlı enjeksiyon oranları kullanılabilir, ancak iğnenin yeniden konumlandırılması sağlanmadan önce daha fazla reflü yaşanabilir.
   18. İntravitreal enjeksiyon yapmadan önce doğru çalıştığından emin olmak için sistemi test edin.
       not: Enjeksiyon sistemi doğru çalıştığında, ayak pedalı veya kontrol pedi kullanılarak bir enjeksiyon döngüsünün etkinleştirilmesi, piston kapağı tutucusunun görünür hareketini üretecek ve iğnenin ucunda küçük bir yeşilimsi sıvı damlası görülecektir. Sıvı üretilmemesi durumunda, ek döngüleri etkinleştirin veya şırıngayı yıkayın ve yeniden doldurun.
   19. Gözü enjekte etmeden önce, iğneyi %95 etanol ped ile nazikçe silin.
3. İntravitreal enjeksiyon prosedürü
   1. Fare, enjeksiyon prosedürünü gerçekleştirmek için stereotaksik bir aparat üzerine yerleştirilir.
   2. Yüzeyine 2-3 adet kağıt havlu takarak mouse'un üzerinde durduğu sahneyi/platformu sıcak tutun.
   3. Fareyi platform üzerinde yüzüstü konuma getirin. Hayvanın kafasını nazikçe sabitlemek için sağ ve sol kulak bantlarını kullanın. Şekil 1E'ye bakın.
   4. Fareyi konumlandırın ve sağ gözün üst burun yönü görünecek şekilde dürbünün altına yönlendirin.
   5. Kirpikleri yerinden çıkarmak ve sklerayı ortaya çıkarmak için 30 G'lik bir iğne kullanın. Limbusu ve radyal kan damarını gözünüzde canlandırın.
   6. Sklerada limbusun 1-2 mm arkasında bir kılavuz delik açmak için steril bir 30 G iğne kullanın.
   7. Enjeksiyon tutucuya takılı 34 G iğneyi, lensten kaçınacak bir açıyla kılavuz delikten göze sokun, ancak iğne ucunu vitreus boşluğuna yerleştirin.
   8. Mikro şırınga pompası kontrolörünü kullanarak, 1 μL Mtb ekstraktını vitreus boşluğuna dikkatlice enjekte edin. Tutarlı reflü durumunda, yeterli doz verilmesini sağlamak için enjeksiyon hacmini 1,5 μL'ye yükseltin.
      not: Sahte kontroller için, hayvanın gözüne 1 μL PBS enjekte edin.
   9. Gözdeki yeşilimsi bir refleksin görselleştirilmesi ile intravitreal yerleşimi doğrulayın. Şekil 1F'ye bakın.
   10. 10 saniye sonra iğneyi gözden çekin. Herhangi bir reflüye dikkat edin.
   11. Fareyi platformdan çıkarın, kornea koruması için her iki gözünüze %0,3 hipromelloz veya %0,2 w/w karbomer göz merhemi yerleştirin ve toparlanma ısıtma kutusuna geçin.
   12. Sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar fareyi gözetimsiz bırakmayın. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirketine geri dönmeyin.
   13. Fare tamamen uyandığında, kafese geri dönün ve asetaminofen (200-300 mg / kg / gün) ilaçlı su şişesini ekleyin. Kafes kartını IVT enjeksiyon tarihi ile etiketleyin.
   14. İntravitreal enjeksiyonlar genellikle iyi tolere edilir. Ağrıyı ve çalışmadan çıkarılma ihtiyacını gösterebilecek klinik belirtiler arasında perioküler alopesi (kendi kendine travmanın göstergesi), kornea ülseri, kilo kaybı ve kambur duruş bulunur.

Sonuçlar

Şekil 1: Fare intravitreal enjeksiyon kurulumu. İntravitreal enjeksiyon, (A) (B) Mikropompaya bağlı bir mikro şırınga pompası kontrolörü ve (C) bir enjeksiyon şırıngası kullanılarak fare gözü üzerinde gerçekleştirilir. Şırınga yüklenir ve (D) Mikro pompaya monte edilir. Fare kafası, intravitreal enjeksiyon prosedürü sırasında stabilit...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
AK-FLÖRT	Akorn İlaç, IL, ABD		5 mL'lik şişede% 10 Floresein sodyum 100 mg / mL
AnaSed	Akorn Hayvan Sağlığı, IL, ABD	NDC 59399-110-20	Ksilazin 20 mg / mL
Betadine% 5 Steril Oftalmik Hazırlık Çözeltisi	Alcon, Teksas, Amerika Birleşik Devletleri	8007-1
B-D Hassas Kayma İğneleri -25 g	Becton, Dickinson ve Şirketi, NJ, ABD	305122
B-D Hassas Kayma iğnesi -30-G	Becton, Dickinson ve Şirketi, NJ, ABD	305106
Tahvil MAX, Tahvil Rx	Leica Biyosistemler, IL, ABD		Otomatik IHC boyama sistemi
Kloramfenikol merhem	Martindale Pharma, Romford, Birleşik Krallık		%1 w/w Kloramfenikol
EG1150H	Leica Biyosistemler, IL, ABD		Doku Gömme
Envisu R2300	Bioptigen/Leica		OCT Makinesi
Freund'un Tamamlanmamış Adjuvanı	BD Difco, NJ, Amerika Birleşik Devletleri	263910
GenTeal kayganlaştırıcı göz merhemi	Alcon, Teksas, Amerika Birleşik Devletleri	---
GenTeal kayganlaştırıcı göz jeli	Alcon, Teksas, Amerika Birleşik Devletleri	---
H37Ra liyofilize Mikobakteri özü	BD Difco, NJ, Amerika Birleşik Devletleri	231141
Hamilton RN İğnesi (33/12/2)S	Hamilton, Reno, NV	7803-05(33/12/2)	33 gr
Hamilton şırınga	Hamilton, Reno, NV	CAL7633-01	5 μL
İnsülin iğnesi	Exel Uluslararası, Amerika Birleşik Devletleri	26029	1 mL
İzofluran
Ketaset	Zoetis, Amerika Birleşik Devletleri	377341	Ketamin HCL 100 mg / mL
Mikroenjeksiyon Şırınga Pompası ve Micro4Controller	Dünya Hassas Aletler, FL, ABD	UMP3
Mikron IV	Phoenix Araştırma Laboratuvarları, Pleasanton, CA		Alternatif Görüntüleme/OCT Makinesi
Nanofil 10 μL şırınga	Dünya Hassas Aletler, FL, ABD	NANOFIL DOSYASI
Nanofil Göz İçi Enjeksiyon Kiti	Dünya Hassas Aletler, FL, ABD	IO-KIT
Olimpos SZX10	Olympus		Diseksiyon kapsamı
Pbs	Gibco (Gibco)	14190
Fenilefrin Hidroklorür Oftalmik Çözelti USP% 2.5 Steril 15 mL	Akorn İlaç, IL, ABD	17478020115
RM2255	Leica Biyosistemler, IL, ABD		Doku Kesit Alma
TB Şırınga	Becton, Dickinson ve Şirketi, NJ, ABD	309602	1 mL
Tetrakain% 0.5	Alcon, Teksas, Amerika Birleşik Devletleri	1041544
Tissue Tek VIP serisi	Sakura Finetek Amerika Birleşik Devletleri, Inc., CA.		Histoloji Doku İşleme
Tropikanit %1	Chauvin İlaç, Romford, Birleşik Krallık		Minimler
Tylenol	Johnson & Johnson Tüketici A.Ş., PA, ABD	NDC 50580-614-01	Asetaminofen
Viskogözyaşı	Novartis İlaç, Camberley, İngiltere		Karbomer göz jeli %0,2 w/w