Enfeksiyon için Mycobacterium bovis BCG lux İnokulumunun Hazırlanması ve Miktar Tayini

Özet

Kaynak: Asai, M. ve diğerleri, Mycobacterium tuberculosis Kompleksini İncelemek İçin Omurgasız Galleria mellonella'nın Enfeksiyon Modeli Olarak Kullanımı. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, biyolüminesans testi ve koloni oluşturan birimlerin sayımı kullanılarak Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin lux inokulumunun hazırlanmasını ve miktar tayinini göstermektedir. Hazırlanan aşı enfeksiyon çalışmaları için kullanılabilir.

Protokol

NOT: Aşağıda açıklanan tüm çalışmalar, yerel sağlık ve güvenlik yönergelerine uygun olarak sınıf 2 mikrobiyolojik güvenlik kabini (MSC) içindeki bir CL2 laboratuvarında gerçekleştirilmelidir.

>1. M. bovis BCG lux'un Enfeksiyon için Hazırlanması

1. Lusiferaz enzimini kodlayan Vibrio harveyi'den luxAB genlerini taşıyan mekik plazmidi pSMT1 ile dönüştürülen Montreal aşı suşu olan M. bovis BCG lux'un donmuş 1.2 mL gliserol (%15) stokunun buzunu çözün.
2. % 0.2 gliserol,% 10 albümin, dekstroz, katalaz (ADC) zenginleştirme ve 50 μg / mL higromisin içeren 15 mL Middlebrook 7H9 et suyunu, etiketli 250 mL Erlenmeyer şişesinde çözülmüş 1.2 mL BCG lux alikotu ile aşılayın.
3. Şişeyi kapalı bir biyogüvenlik kabına yerleştirin ve 37 °C'de 220 rpm'de bir orbital çalkalayıcı inkübatörde 72 saat boyunca (veya kültür, büyümenin orta log aşamasına ulaşana kadar) inkübe edin.
4. Fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4, 0.01 M fosfat tamponu, 0.0027 M potasyum klorür ve 0.137 M sodyum klorür) kullanarak luminometre tüplerinde kültürün 1:10 seyreltmesini hazırlayarak BCG lux kültürünün büyümesini kontrol edin. Vorteks yapın ve luminometre tüplerini luminometreye yükleyin ve substrat olarak n-desil aldehit (mutlak etanolde %1 v/v) kullanarak biyolüminesansı (bağıl ışık birimi [RLU]/mL) ölçün.
   not: RLU/koloni oluşturan birimlerin (CFU) oranı daha önce BCG lux Middlebrook 7H9 suyunda in vitro olarak yetiştirildiğinde 3:1 olarak belirlenmişti.
5. Hücreleri peletlemek için kültürü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 2.175 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı bilinen mikobakterisidal aktiviteye sahip uygun bir dezenfektana atın. Tüm kültür atıklarını yerel yönergeleri izleyerek mikobakterilere uygun dezenfektanlarla atın.
6. Bakteri topaklanmasını önlemek için hücre peletini %0.05 polisorbat 80 (PBS-T) içeren PBS'de iki kez yıkayın.
7. Son yıkamanın ardından, atık süpernatanı boşaltın, PBS-T'deki mikobakteriyel hücre peletini yeniden süspanse edin ve mikobakteriyel süspansiyonu RLU ölçümlerini kullanarak istenen hücre yoğunluğuna seyreltin.
8. PBS-T kullanarak 24 oyuklu plakalarda aşının on kat seri seyreltmelerini hazırlayın. İnokulum CFU sayımlarını numaralandırmak için Middlebrook 7H11 agar plakalarına (%0.5 gliserol, 50 μg/mL higromisin, %10 oleik asit, albümin, dekstroz, katalaz [OADC]) 10 μL koyun.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1.5ml reaksiyon tüpü (Eppendorf)	Eppendorf Belediyesi	22431021
20, 200 ve 1000 μl pipet ve filtreli uçlar	Herhangi bir tedarikçi	Yok
24 oyuklu kültür plakası	Greiner	662160
25 ml pipet ve pipet çocuğu	Herhangi bir tedarikçi	Yok
3 bölmeli Petri kabı (94/15mm)	Greiner	637102
merkezkaç	Herhangi bir tedarikçi	Yok
Sınıf II güvenlik kabini	Herhangi bir tedarikçi	Yok
Etanol (>99.7%)	VWR (VWR)	208221.321
Gliserol	Sigma-Aldrich	G5150
Higromisin B	Corning	30-240 CR
Luminometre (Autolumat LB 953)	Berthold	34622
Luminometre tüpleri	Corning	352054
Mikrosantrifüj	Herhangi bir tedarikçi	Yok
Middlebrook 7H11 agar	BD Biyobilim	283810
Middlebrook 7H9 suyu	BD Biyobilim	271310
Middlebrook ADC zenginleştirme	BD Biyobilim	212352
Middlebrook OADC zenginleştirme	BD Biyobilim	212240
Mikobakteri bovis BCG lux	çeşitli	Yok
n-desil aldehit	Sigma-Aldrich	D7384-100G
Orbital sallama inkübatörü	Herhangi bir tedarikçi	Yok
Fosfat tamponlu tuzlu su	Sigma-Aldrich	P4417-100SEKME
Polisorbat 80 (Ara-80)	Sigma-Aldrich	P8074-500ml
Havalandırmalı kapaklı erlenmeyer şişesi (250 ml)	Corning	CLS40183
Winterm (v1.08)	Berthold	Yok	LB953.TTB Programı