NOT: Aşağıda açıklanan tüm çalışmalar, yerel sağlık ve güvenlik yönergelerine uygun olarak sınıf 2 mikrobiyolojik güvenlik kabini (MSC) içindeki bir CL2 laboratuvarında gerçekleştirilmelidir.
>1. M. bovis BCG lux'un Enfeksiyon için Hazırlanması
- Lusiferaz enzimini kodlayan Vibrio harveyi'den luxAB genlerini taşıyan mekik plazmidi pSMT1 ile dönüştürülen Montreal aşı suşu olan Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG) lux'un donmuş 1.2 mL gliserol (%15) stokunun buzunu çözün.
- % 0.2 gliserol,% 10 albümin, dekstroz, katalaz (ADC) zenginleştirme ve 50 μg / mL higromisin içeren 15 mL Middlebrook 7H9 et suyunu, etiketli 250 mL Erlenmeyer şişesinde çözülmüş 1.2 mL BCG lux alikotu ile aşılayın.
- Şişeyi kapalı bir biyogüvenlik kabına yerleştirin ve 37 °C'de 220 rpm'de bir orbital çalkalayıcı inkübatörde 72 saat boyunca (veya kültür, büyümenin orta log aşamasına ulaşana kadar) inkübe edin.
- Fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4, 0.01 M fosfat tamponu, 0.0027 M potasyum klorür ve 0.137 M sodyum klorür) kullanarak luminometre tüplerinde kültürün 1:10 seyreltmesini hazırlayarak BCG lux kültürünün büyümesini kontrol edin. Vorteks yapın ve luminometre tüplerini luminometreye yükleyin ve substrat olarak n-desil aldehit (mutlak etanolde %1 v/v) kullanarak biyolüminesansı (bağıl ışık birimi [RLU]/mL) ölçün.
NOT: RLU/koloni oluşturan birimlerin (CFU) oranı daha önce BCG lux Middlebrook 7H9 suyunda in vitro olarak yetiştirildiğinde 3:1 olarak belirlenmişti.
- Hücreleri peletlemek için kültürü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 2.175 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı bilinen mikobakterisidal aktiviteye sahip uygun bir dezenfektana atın. Tüm kültür atıklarını yerel yönergeleri izleyerek mikobakterilere uygun dezenfektanlarla atın.
- Bakteri topaklanmasını önlemek için hücre peletini %0.05 polisorbat 80 (PBS-T) içeren PBS'de iki kez yıkayın.
- Son yıkamanın ardından, atık süpernatanı boşaltın, PBS-T'deki mikobakteriyel hücre peletini yeniden süspanse edin ve mikobakteriyel süspansiyonu RLU ölçümlerini kullanarak istenen hücre yoğunluğuna seyreltin.
- PBS-T kullanarak 24 oyuklu plakalarda aşının on kat seri seyreltmelerini hazırlayın. İnokulum CFU sayımlarını numaralandırmak için Middlebrook 7H11 agar plakalarına (%0.5 gliserol, 50 μg/mL higromisin, %10 oleik asit, albümin, dekstroz, katalaz [OADC]) 10 μL koyun.
2. G. mellonella Larvalarının Hazırlanması
- Son instar larvalarını uygun kaynaklardan satın alın ve larvaları varışta karanlıkta 18 °C'de saklayın ve satın alma tarihinden itibaren 1 hafta içinde kullanın. Alternatif olarak, larvalar Jojāo ve ark.'nın protokolüne göre kendi kendine yetiştirilebilir. Satın alınan larvalar için, depolamadan önce ölü, rengi solmuş veya pupa larvaları atın.
NOT: Pupa larvaları morfolojik olarak son instar larvalarından ayırt edilebilir.
- Çok az veya hiç renk değişikliği (melanizasyon), boyut (2-3 cm uzunluğunda), ağırlık (yaklaşık 250 mg), yüksek düzeyde hareketlilik gösteren ve döndürüldüğünde kendilerini düzeltme yeteneğine sahip tek tip krem rengine dayalı olarak deney için sağlıklı larvaları tanımlayın ve seçin.
- Sağlıklı larvaları (grup başına en az 20-30 adet), kontaminasyonu en aza indirmek için künt uçlu cımbız kullanarak bir filtre kağıdı tabakası (94/15 mm) ile kaplı bir Petri kabına (94/15 mm) dikkatlice sayın ve oda sıcaklığında karanlıkta saklayın.
3. G. mellonella'yı BCG lux ile enfekte etmek
- Kontaminasyon ve iğne batması yaralanması riskini azaltmak için MSC içindeki dağınıklığı en aza indirin.
- Düz yükseltilmiş bir yüzeye dairesel bir filtre kağıdı (94 mm) bantlayarak enjeksiyon platformunu hazırlayın. Yumuşak veya sert yüzeyler kullanılabilir ve bunlar tamamen kullanıcı tercihine bağlıdır, örneğin pipet kutusu kapakları veya naylon ovma süngeri.
- 25 μL'lik bir mikroşırıngayı (25 G) 3 hacim% 70 etanol aspire ederek sterilize edin ve 3 hacim steril PBS-T ile daha fazla durulayın.
- 10 μL BCG lux inoculum (bölüm 1'de hazırlanmıştır) veya PBS-T'yi sterilize edilmiş 25 μL'lik mikroşırıngaya aspire edin. PBS-T negatif kontrolü için ayrı bir şırınga kullanın.
NOT: Düzgün hücre süspansiyonunu sağlamak için 10 enjeksiyondan sonra BCG lux aşısını yeniden askıya alın .
- Bir larvayı almak için cımbız kullanın ve enjeksiyon platformuna yerleştirin.
- Platformda larvayı sırtına çevirin ve başını ve kuyruğunu cımbızla sabitleyerek hareketsiz hale getirin. Larvanın başından geriye doğru geri sayan son sol prolegi bulun ve iğnenin ucunu (5−6 mm) yatay düzleme 10−20° açıyla dikkatlice yerleştirin.
not: Kısa ve dar cımbızlar, minimum larva stresi ile kolay immobilizasyona izin verir. Bağırsakları delebilecek ve BCG dışı lux spesifik melanizasyona veya ölüme neden olabilecek aşırı nüfuz etmemeye dikkat edin.
- Enfekte larvaları bir filtre kağıdı tabakası ile kaplı bir Petri kabına sayın, tek bir 90 mm'lik Petri kabı 30'a kadar larvayı barındırabilir.
- Larvaları içeren Petri kabını, 37 ° C'de% 5 CO2 ile bir inkübatör içinde havalandırmalı veya sızdırmaz bir karanlık kutuda saklayın.
4. Enfeksiyon Sonrası G. mellonella'nın Hayatta Kalmasının İzlenmesi
- Zaman boyunca, her 24 saatte bir larvaların hayatta kalmasını izleyin. Larvalar, dokunmaya tepki olarak hareket edemediklerinde ölü olarak kabul edilir.
5. BCG lux'un In Vivo Yükünün Ölçülmesi G. mellonella'da
- Her zaman noktasında, daha önce bölüm 3'te hazırlanmış beş enfekte larvayı rastgele seçin ve larva yüzeylerini %70 etanole batırılmış pamuklu çubuklar kullanarak nazikçe sterilize edin.
NOT: Bu adım, sterilize edilmemiş larvalar kontaminasyona yol açabileceğinden, mikobakteriyel CFU sayımı için larva homojenat kaplanırken önemlidir.
- Larvaları tek tek 800 μL steril PBS içeren 2 mL parçalama matris tüplerine yerleştirin.
- Larvaları 6,0 m/s'de 60 sn boyunca bir homojenizatör kullanarak homojenize edin.
- Homojenatı kapaklardan çıkarmak için parçalama tüplerini 5 saniye boyunca 3.500 x g'da santrifüjleyin ve homojenatı ayrı ayrı steril luminometre tüplerine dikkatlice boşaltın.
not: CFU sayımı için (adım 5.7), steril bir 1.5 mL reaksiyon tüpünde 100 μL homojenat ayırdığınızdan emin olun.
- Parçalama matris tüplerini 1 mL PBS-T ile yıkayarak kalan homojenatı geri kazanın ve ilgili luminometre tüplerine pipetleyin.
- Luminometre tüplerini girdaplayın ve daha önce adım 1.4'te açıklanan homojenatların biyolüminesansını ölçün.
- PBS-T kullanarak 24 oyuklu kültür plakalarında homojenatın on kat seri seyreltmelerini hazırlayın. İn vivo enfeksiyonu takiben BCG lux'ün RLU/CFU oranını belirlemek için %0.5 gliserol, 50 μg/mL higromisin, %10 OADC ve 20 μg/mL piperasilin içeren Middlebrook 7H11 agar plakalarına 10 μL seyreltme uygulayın.
NOT: Piperasilin, BCG lux'un minimum büyüme inhibisyonu ile doğal G. mellonella mikrobiyotasını ortadan kaldırır.
