Lipopolisakkarit ile İndüklenen İnflamatuar Eksüda Toplama için Bir Hava Torbası Fare Modeli

Özet

Kaynak: Lu, Q., et al. Farelerde nötrofillerin göçünü ve sızmasını tespit etmek. J. Vis. Uzm.(2020).

Bu videoda, farelerin deri altı dokusunda bir hava torbası oluşturma ve in vivo lipopolisakkarit uygulamasına yanıt olarak inflamatuar eksüdaları toplama prosedürü açıklanmaktadır.Bu video aynı zamanda hava torbasındaki nötrofil infiltrasyonunun analizini de kapsar.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Hava kesesi tahlili

1. İlk hava enjeksiyonu
   1. 0. günde, fareleri% 5 izofluran ile 2 L / dk hızında bir gaz anestezi odasında 3 dakika boyunca tamamen uyuşturun ve her farenin anestezisini 0.5 L / dk hızında% 2 izofluran içeren tek bir solunum ünitesinde koruyun.
      not: Fareleri odadan tek solunum ünitesine taşımadan önce ayak parmakları sıkıştırılarak yeterli anestezi derinliği sağlanır. Ayak parmakları sıkıştığında bacaklar hareket etmemelidir.
   2. 3 mL hacimde sterilize hava elde etmek için 5 mL'lik bir şırıngaya bağlı 0,22 μm'lik bir filtre kullanın.
   3. Anestezi uygulanmış farenin arka derisini cımbızla kaldırın ve 26 G x 3/8" iğne kullanarak deri altına 3 mL sterilize hava enjekte edin.
   4. Tedaviden sonra fareleri solunum ünitesinden çıkarın. Hareket etmeye başlayana kadar hayatta olduklarından emin olmak için fareleri izleyin.
2. İkinci hava enjeksiyonu
   1. 3. günde, bölüm 3'de açıklandığı gibi hava torbasını sürdürmek için önceden kurulmuş hava cebine 1.1 mL daha sterilize hava enjekte edin.
3. muamele
   1. Kurban kesmeden 6 saat önce, 6. günde, hava kesesine farklı tedaviler enjekte edin. Negatif kontrol olarak 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) enjekte edin. Lokal inflamasyonu indüklemek için pozitif kontrol olarak 1 mL 1 μg / mL LPS enjekte edin.
   2. Fareleri %5 izofluran ile bir gaz anestezi odasında 2 L / dk hızında 3 dakika boyunca tamamen uyuşturun ve her farenin anestezisini 0,5 L / dk hızında% 2 izofluran içeren tek bir solunum ünitesinde tutun. Yıkama tamponunu Malzeme Tablosuna göre hazırlayın.
      not: Fareleri odadan tek solunum ünitesine taşımadan önce ayak parmakları sıkıştırılarak yeterli anestezi derinliği sağlanır. Ayak parmakları sıkıştığında bacaklar hareket etmemelidir.
   3. Her hava torbası için, hava torbasını 1 mL yıkama tamponu ile yıkayın ve enflamatuar eksüdayı 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın. Hava torbasını 2 mL yıkama tamponu 2x ile yıkayın ve enflamatuar eksüdayı aynı santrifüj tüpünde toplayın.
   4. RT'de 10 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri 1 mL yıkama tamponunda yeniden süspanse edin. Otomatik hematoloji analizörünü kullanarak nötrofil oranını ölçmek için hücreleri sayın.
      not: Şekil 1'deki temsili sonuçlara bakın.

Sonuçlar

Şekil 1: Hava torbası testinin temsili sonuçları. (A) Hava torbası testinin çizimi. (B) Hava torbası testinde lökosit alt kümesi infiltrasyonunun temsili sonuçları. PBS: kontrol; LPS: 1 μg/mL LPS. Veriler ortalama ± SD olarak sunulur.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
%100 Etanol	Pekin Kimya İşleri
%100 Metanol	Pekin Kimya İşleri
15 mL Konik Polipropilen Santrifüj Tüpü	doğan	doğan
23 G x 1 1/4" İğne	Bd	305120
26 G x 3/8" İğne	Bd	305110
30 G x 1/2" İğne	Bd	305106
5 mL Şırınga	Bd	Z683574
50 mL Konik Polipropilen Santrifüj Tüpü	doğan	14-432-22
Gaz Anestezi Sistemi	ZS Dichuang	ZS-MV-IV
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS), 1×			%90 ddH2O'yu %10 (h/h) 10×PBS ile karıştırın, otoklavlanmış
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS), ×10			16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·2H2O, 0.48 g KH2PO4'ü (susuz) 200 mL ddH2O'da çözün, pH 7.4'ü ayarlayın, otoklavlanmış
Lipopolisakkarit (LPS)	Sigma	L3012
Hava Torbası Testinde Yıkama Tamponu			HBSS ile 0,5 M EDTA'yı 10 mM'ye seyreltin

Serisi Serisi