Enfekte Bir Fare Midesinde Helicobacter pylori Yükünün Miktarının Belirlenmesi

Özet

Kaynak: D'Costa, K. et al., <a href="https://app.jove.com/v/56985">Helicobacter Enfeksiyonu ve Mide Patolojilerinin Fare Modelleri. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu videoda, kolonizasyonunu doğrulamak için enfeksiyon sonrası fare mide dokularındaki Helicobacter pylori yükünü ölçmek için bir protokol açıklıyoruz.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Enfeksiyon Sonrası Midede Bakteriyel Kolonizasyonun Doğrulanması

1. Midede H. pylori'nin Canlı Sayımı
   1. Enfekte fare midelerinden koloni sayımı yapmadan önce steril HBA plakalarını ek antibiyotiklerle (200 μg/mL basitrasin ve 10 μg/mL nalidiksik asit) destekleyin.
   2. Mide bölümlerini manuel olarak, otoklavlanabilir polipropilen mikro tokmaklar kullanarak veya mekanik bir ayrıştırma aleti kullanarak homojenize edin (bkz. Malzeme Tablosu).
   3. Elde edilen mide homojenatlarının steril BHI.
      içinde çift seri dilüsyonlarını (10⁻¹ ila 10⁻²) hazırlayın not: Seyreltmelere, enfeksiyon için kullanılan belirli bir H. pylori suşu için elde edilen tipik bakteri yüklerine ve enfeksiyon süresine göre karar verilmelidir. Seyreltilmemiş numuneler de kullanılabilir.
   4. Önceden kurutulmuş HBA plakalarını (NOT: Tek kolonilerin izolasyonunu sağlamak için, HBA plakaları kullanımdan önce 10-15 dakika boyunca biyolojik güvenlik kabininde veya 37 ° C'lik inkübatörde ısıtılmalı ve kurutulmalıdır.) üç veya dört parçaya bölün. Miles ve Misra tekniğinin bir uyarlamasını kullanarak, agar plakasının bir segmentine her seyreltmeden 10-100 mL ekleyin ve steril plastik halkalar kullanarak yayın.
   5. Plakaların kurumasını bekleyin ve ardından ters konumda (kapak tarafı aşağı bakacak şekilde) anaerob gaz kavanozlarına yerleştirin. Kavanozlardaki nemi korumak için su içeren bir Petri kabı ekleyin.
   6. Kavanozları koloniler oluşana kadar (tipik olarak 4-7 gün) 37 °C'de inkübe edin.
   7. 10 ila 100 izole koloni içeren segment(ler)i numaralandırın.
      NOT: Plakalar üzerindeki H. pylori kolonileri ve H. felis büyümesi, standart üreaz, katalaz ve oksidaz testleri kullanılarak murin mide mikrobiyotasının diğer üyelerinden ayırt edilebilir. H. pylori ve H. felis her üç test için de pozitiftir.
   8. Aşağıdaki formülü kullanarak bakteri yüklerini (CFU/g doku) olarak hesaplayın:
      [(Sayılan ortalama koloni sayısı) × (seyreltme faktörü) x (hacim kaplama)]/(mide ağırlığı).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Bakteriyolojik reaktifler
Oksoit Kan Agar Tabanı No.2	Thermo Fischer Bilimsel	CM0271B	Sterilizasyondan önce deinonize suda çözün
Premium Defibrinasyonlu At kanı	Avustralya Etik Biyolojikleri	PDHB100
Bacto Beyin Kalp İnfüzyon Suyu	BD Biyobilim	237500	Sterilizasyondan önce deinonize suda çözün
CampyGen gaz paketleri	Thermo Fischer Bilimsel	CN0035A/CN0025A
Antibiyotik
Vankomisin	Sigma Aldrich	V2002-1G	Deiyonize suda çözün
Polimiksin B	Sigma Aldrich	P4932-5MU	Deiyonize suda çözün
Trimetoprim (% ≥98 HPLC)	Sigma Aldrich	T7883 Serisi	% 100 (mutlak) Etanol içinde çözün
Amfoterisin	Amresco (Astral Bilimsel)	E437-100MG	Deiyonize suda çözün
Bacillus licheniformis'ten Bacitracin	Sigma Aldrich	B0125	Deiyonize suda çözün
Naladixic asit	Sigma Aldrich	N8878	Deiyonize suda çözün
Ekipman ve plastik eşyalar
Oksoit Anaerobik Kavanozlar	Thermo Fischer Bilimsel	HP0011/HP0031
COPAN Pastör Pipetleri	Interpath Hizmetleri	200CS01
Eppendorf 5810R santrifüj			4 ° C'de 10 dakika boyunca 2.200 rpm'de santrifüjleme yoluyla bakteri peletlerini toplayın
Parafilm M	Bemis, VWR	PM996
1,2 - 2 mL tüpler için Eppendorf mikro havaneli	Sigma Aldrich	Z317314	Mide homojenizasyonu için kullanılan otoklavlanabilir polipropilen tokmaklar
GentleMACs Ayrıştırıcı	Miltenyi Biyotec	130-093-235	Fare mide dokusu için önceden ayarlanmış bir gentleMACS Programları kullanın
M Tüpler (turuncu kapak)	Miltenyi Biyotec	30-093-236
Kübit Florometre	Thermo Fischer Bilimsel	Q33216
Steril plastik halka	LabServ (Laboratuvar Hizmeti	LBSLP7202