$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Kateterlerin Hazırlanması
- Enfekte olacak her fare grubu için bir pediatrik intravenöz erişim kanülü hazırlayın. Dahili yay mekanizmasını kullanarak, üreticinin talimatına göre her bir kanülü iğnesinden çıkarın. Sadece plastik intravenöz kanülü koruyarak iğneleri atın.
- Kateterleri, tipik olarak 25 - 30 dk.
olmak üzere bir ultraviyole (UV) döngüsü için laminer akış başlığında sterilize edin
Not: Kateterler birden fazla fare için kullanılabilir, ancak deney grupları, cinsiyetler veya bakteri suşları arasında yeni bir kateter kullanılmalıdır.
2. Enfeksiyon için Üropatojenik E. coli'nin Hazırlanması
- Enfeksiyondan en az iki gün önce, steril bir aşılama döngüsü kullanarak, donmuş bir bakteri stoğundan UPEC'i uygun şekilde antibiyotik içeren bir Luria Suyu (LB) agar plakasına sürün. Gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. Plakalar 4 °C'de bir haftaya kadar saklanabilir.
- 100 ml'lik steril bir Erlenmeyer şişesinde, uygunsa antibiyotik içeren 10 ml LB'yi, LB plakasından tek bir koloni ile aşılayın ve gece boyunca (yaklaşık 16 - 18 saat) 37 ° C'de bekletin (
Not: Ayakta duran kültürler, enfeksiyon için gerekli olan tip 1 pili'nin ekspresyonuna izin verir. Çalkalayarak yetiştirilen kültürler daha az verimli pili ekspresyonuna ve dolayısıyla tutarsız enfeksiyon oranlarına sahip olacaktır.
- Gece boyunca kültürün optik yoğunluğunu (OD) 600 ölçün ve önceden belirlenmiş bir büyüme eğrisi kullanarak ml başına bakteri sayısını hesaplayın. Örnek olarak, UPEC suşu UTI89 için, OD600 = 0.35, ml başına 2 x 108 CFU'ya eşdeğerdir, bu nedenle, OD600 = 2.4 olan bir gecelik kültür, ml başına 13.7 x 108 CFU'ya eşdeğer olacaktır. Enfeksiyon için kullanılan her yeni suş ile OD600 ve canlı bakteriler arasındaki ilişkiyi ampirik olarak belirleyin.
- Enfekte olacak hayvan sayısını göz önünde bulundurarak ihtiyaç duyulan bakteri miktarını belirleyin ve her farenin 50 μl PBS'de yaklaşık 107 koloni oluşturan birim (CFU) alması gerektiğini belirleyin. Hesaplamaya, kateter ve şırınga yumrusunun ~ 130 μl ölü hacmini ve aşıyı belirlemek için gereken 100 μl'yi dahil edin.
- Bakteriyel süspansiyonu 1 dakika boyunca 17.000 x g'da bir masa üstü mikrosantrifüjde döndürün ve elde edilen bakteri peletini PBS'de ml başına 2 x 108 CFU'da yeniden süspanse edin. Bu süspansiyonun bir alikotunu seri olarak seyreltin ve her enfeksiyon için kesin inokulumu belirlemek için uygunsa antibiyotiklerle LB agar üzerine plakalayın.
- Bakteri aşısını 1 ml'lik bir şırıngaya çekin ve kateteri şırınganın ucuna takın. Havayı çıkarmak için şırıngaya dokunun ve damlatmaya başlamadan önce kateterdeki ölü hava boşluğunu doldurmak için pistona basın.
3. Farelerin Hazırlanması
- 100 mg / kg ketamin ve 5 mg / kg ksilazin intraperitoneal enjeksiyonu ile fareleri uyuşturun. Ek ısı sağlanabilir.
- Ayak tabanını orta basınçla sıkarak her farenin tamamen yatıştırıldığından emin olun. Fareler reaksiyona girmediklerinde tamamen yatıştırılır ve bu duruma ulaşmak için 3-5 dakikaya ihtiyaç duyarlar.
- Fareleri sırtüstü yatırın ve idrar kesesini boşaltmak için alt karın bölgesine orta basınç uygulayın. Tam mesaneler, iliak tepeler arasındaki derinin altında bir bezelye gibi hissedilir.
Not: Dişi fareleri kateterize etmek için inhale izofluran kullanılmıştır, ancak erkek farelerin bu prosedür için inhale izofluran ile yeterince anestezi uygulanıp uygulanmadığı test edilmemiştir.
4. Erkek Farelerin Transüretral Damlatılması
- İki başparmak forsepsini farenin dış genital organına kraniyal ve kaudal olarak yerleştirin. Glans penisini tamamen ortaya çıkarmak için prepusu geri çekin. Penis dışarıdan konumlandırıldıktan sonra, başparmak forsepslerini serbest bırakın.
- Organı nazikçe ama gergin bir şekilde tutarak hayvana dik olarak çıkıntılı penisi stabilize etmek için forsepsleri yeniden konumlandırın. Üretral meatusu görselleştirin ve kateteri organın ucundaki küçük açıklığa dikkatlice yerleştirin. Kateteri nazikçe penisin içine, farenin gövdesine doğru yönlendirin ve forseps ile hafif bir gerginlik sağlayın. Kateter yağlama gerektirmez. Kateteri penise zorlamayın; Kateter, üretraya düzgün bir şekilde kaymalı ve doğru yerleşimi göstermelidir.
- Kateterin göbeği penisin ucuyla buluştuğunda, penisin pozisyonunu korurken 50 μl aşıyı çok yavaş bir şekilde dağıtın. Damlatmanın kalitesi, Şekil 1'de gösterildiği gibi önceden belirlenmiş bir damlatma kalite puanına göre şu anda not edilebilir.
- Aşının sızmasını önlemek için kateteri 5'in üzerinde yavaşça geri çekin. Fareleri sırtüstü pozisyonda kafeslerine yerleştirin. Hayvanlar, anestezik uygulandıktan 30-45 dakika sonra iyileşmeye başlamalıdır.
