Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Kateterlerin Hazırlanması
- Enfekte olacak her fare grubu için bir pediatrik intravenöz erişim kanülü hazırlayın. Dahili yay mekanizmasını kullanarak, üreticinin talimatına göre her bir kanülü iğnesinden çıkarın. Sadece plastik intravenöz kanülü koruyarak iğneleri atın.
- Kateterleri, tipik olarak 25 - 30 dk.
olmak üzere bir ultraviyole (UV) döngüsü için laminer akış başlığında sterilize edin
not: Kateterler birden fazla fare için kullanılabilir, ancak deney grupları, cinsiyetler veya bakteri suşları arasında yeni bir kateter kullanılmalıdır.
2. Enfeksiyon için Üropatojenik Escherichia coli'nin Hazırlanması
- Enfeksiyondan en az iki gün önce, steril bir aşılama döngüsü kullanarak, üropatojenik Escherichia coli'yi (UPEC) donmuş bir bakteri stoğundan, uygunsa antibiyotik içeren bir Luria Broth (LB) agar plakasına çizin. Gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. Plakalar 4 °C'de bir haftaya kadar saklanabilir.
- 100 ml'lik steril bir Erlenmeyer şişesinde, uygunsa antibiyotik içeren 10 ml LB'yi, LB plakasından tek bir koloni ile aşılayın ve gece boyunca (yaklaşık 16 - 18 saat) 37 ° C'de bekletin (
not: Ayakta kültürler, enfeksiyon için gerekli olan tip 1 pili'nin ekspresyonuna izin verir. Çalkalayarak yetiştirilen kültürler daha az verimli pili ekspresyonuna ve dolayısıyla tutarsız enfeksiyon oranlarına sahip olacaktır.
- Gece boyunca kültürün optik yoğunluğunu (OD) 600 ölçün ve önceden belirlenmiş bir büyüme eğrisi kullanarak ml başına bakteri sayısını hesaplayın. Örnek olarak, UPEC suşu UTI89 için, OD600 = 0.35, ml başına 2 x 108 koloni oluşturan birime (CFU) eşdeğerdir, bu nedenle, OD600 = 2.4 olan bir gece kültürü, ml başına 13.7 x 108 CFU'ya eşdeğer olacaktır. Enfeksiyon için kullanılan her yeni suş ile OD600 ve canlı bakteriler arasındaki ilişkiyi ampirik olarak belirleyin.
- Enfekte olacak hayvan sayısını göz önünde bulundurarak ihtiyaç duyulan bakteri sayısını belirleyin ve her farenin 50 μl fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yaklaşık10 7 koloni oluşturan birim (CFU) alması gerektiğini belirleyin. Hesaplamaya, kateter ve şırınga yumrusunun ~ 130 μl ölü hacmini ve aşıyı belirlemek için gereken 100 μl'yi dahil edin.
- Bakteriyel süspansiyonu 1 dakika boyunca 17.000 x g'da bir masa üstü mikrosantrifüjde döndürün ve elde edilen bakteri peletini PBS'de ml başına 2 x 108 CFU'da yeniden süspanse edin. Bu süspansiyonun bir alikotunu seri olarak seyreltin ve her enfeksiyon için kesin inokulumu belirlemek için uygunsa antibiyotiklerle LB agar üzerine plakalayın.
- Bakteri aşısını 1 ml'lik bir şırıngaya çekin ve kateteri şırınganın ucuna takın. Havayı çıkarmak için şırıngaya dokunun ve damlatmaya başlamadan önce kateterdeki ölü hava boşluğunu doldurmak için pistona basın.
3. Farelerin Hazırlanması
- 100 mg / kg ketamin ve 5 mg / kg ksilazin intraperitoneal enjeksiyonu ile fareleri uyuşturun. Ek ısı sağlanabilir.
- Ayak tabanını orta basınçla sıkarak her farenin tamamen yatıştırıldığından emin olun. Fareler reaksiyona girmediklerinde tamamen yatıştırılır ve bu duruma ulaşmak için 3-5 dakikaya ihtiyaç duyarlar.
- Fareleri sırtüstü yatırın ve idrar kesesini boşaltmak için alt karın bölgesine orta basınç uygulayın. Tam mesaneler, iliak tepeler arasındaki derinin altında bir bezelye gibi hissedilir.
not: Dişi fareleri kateterize etmek için inhale izofluran kullanılmıştır, ancak erkek farelerin bu prosedür için inhale izofluran ile yeterince anestezi uygulanıp uygulanmadığı test edilmemiştir.
4. Dişi Farelerin Transüretral Damlatılması
- Baskın olmayan eli kullanarak, başparmağınızı kuyruğuna ve aynı elin parmağını farenin karnına yerleştirin ve fareyi sıkıca yerinde tutmak için zıt yönlere hafif bir baskı uygulayın.
- Kateterin ucunu üretral deliğe fareye dik olarak yerleştirin. Hafif bir basınçla, göbek üretral delikle buluşana kadar kateteri üretranın içine kaydırın ve aynı anda şırıngayı çalışma yüzeyine paralel olacak şekilde indirin. Kateter yağlama gerektirmez. Kateteri üretranın içine itmeyin veya zorlamayın. Kateter, çok az dirençle veya hiç direnç göstermeden üretraya düzgün ve kolay bir şekilde kaymalıdır.
- İnokuluma damla yaptırmadan önce (adım 4.3), kateter yerleştirildikten sonra, zaten farenin karnında bulunan baskın olmayan elin parmağıyla karın derisini farenin başına doğru çok nazikçe çekin (adım 4.1). Kateter üretranın içindeyse, üretra deliğini oluşturan doku hareket etmeyecek, kateter vajinaya yanlış yerleştirilmişse, doku kateterden yukarı ve uzağa hareket edecektir. Bu hızlı test her farede yapılmalıdır.
- Kateterin göbeği üretral delikle buluştuğunda, 50 μl bakteri aşısını yavaşça dağıtın. Yavaş bir damlatma hızı, böbreğe vezikoüreteral reflüyü en aza indirir. Sızıntıyı önlemek için kateteri 5'ten fazla sayıyla yavaşça çıkarın. Fareleri sırtüstü pozisyonda kafeslerine yerleştirin.
