Üropatojenik E. coli ile Enfekte Fare Mesane Dokusunda Akış Sitometrisi Kullanılarak İmmün Hücre İnfiltrasyonunun Ölçülmesi

Özet

Kaynak: Zychlinsky Scharff, A. et al., Küçük Bir Hayvan Modelinde İdrar Yolu Enfeksiyonu: Erkek ve Dişi Farelerin Transüretral Kateterizasyonu. (2017)

Bu videoda, bağışıklık hücresi infiltrasyonunu ölçmek için Escherichia coli ile enfekte fare mesanesindeki CD45⁺ bağışıklık hücrelerini ölçmek için akış sitometrisi tabanlı bir teknik gösteriyoruz.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

>1. Mesane Dokusunun Flow Sitometrik Analizi

1. PBS'de 34 birim / mL'de kollajenaz ve 100 μg / mL'de DNaz içeren sindirim tamponu hazırlayın. Buz üzerinde tutun. Analiz edilecek hayvan başına 15 ml'lik bir konik tüp hazırlayın ve tüp başına 1 ml sindirim tamponu hazırlayın.
2. Önceden belirlenmiş zaman noktalarında, onaylanmış standart çalışma prosedürlerini (örneğin, servikal çıkık veya aşırı dozda karbondioksit) kullanarak fareleri kurban edin. Kürkün neden olduğu kontaminasyonu en aza indirmek için karnı% 70 etanol ile iyice nemlendirin.
3. Makas kullanarak farenin karnının alt üçte birlik kısmı boyunca en az 2 cm'lik bir kesi yapın ve mesanenin tamamını çıkarın. Makasla iyice kıyın, mesaneyi 2 - 3 mm² boyutlu parçalara, tipik olarak yaklaşık 8 parçaya kesin.
   1. Sindirim tamponu içeren tüp başına bir kıyılmış mesane ekleyin. Kıyılmış mesane dokusunu sindirim tamponuna yıkamak için çalkalayın. Tüm mesaneler kesilene ve kıyılana kadar buz üzerinde tutun.
4. Kıyılmış mesaneleri 37 °C'de 60 - 75 dakika inkübe edin ve her 15 dakikada bir 5 saniye boyunca elle kuvvetlice çalkalayın. Doku, ıslak kağıt mendili andıran camsı şeffaf bir görünüme sahip olduğunda sindirim tamamlanır. Uzun süreli sindirim, yüzey proteinlerini tanımlama için gerekli hücrelerden uzaklaştırır ve bundan kaçınılmalıdır.
5. 2-3 mL buz gibi soğuk akışlı sitometri tamponu (% 2 fetal sığır serumu (FBS) ve 0.2 mM EDTA içeren PBS) ekleyerek sindirim enzimlerini inaktive edin ve hafifçe karıştırın. Tüpleri buzun üzerine yerleştirin.
6. Tek hücreli bir süspansiyon sağlamak ve herhangi bir bağ dokusunu çıkarmak için, tüpün içeriğini 15 mL'lik konik bir tüpe yerleştirilmiş 100 μm'lik bir filtreden geçirin. Kalan dokuyu bir şırınga pistonunun ucuyla filtreden yavaşça bastırın. Filtreyi ek bir 2 mL akış sitometri tamponu ile yıkayın. Numuneleri buz üzerinde tutun.
7. Numuneleri 200 x g, 4 °C'de 7 dakika santrifüjleme ile yıkayın. Peletleri Fc bloğu içeren 100 μL akış sitometrisi tamponunda yeniden süspanse edin, 5 μg / mL'ye seyreltin ve 96 oyuklu yuvarlak bir alt plakaya aktarın. 10 - 15 dakika sonra, her numuneye 100 μL istenen antikor kokteyli ekleyin. Numuneleri 30 - 45 dakika, buz üzerinde, ışıktan korunarak inkübe edin.
   not: Fc bloğu, antikorların Fc kısmının Fc reseptörlerini eksprese eden hücrelere bağlanmasını önlemek için kullanılan bir reaktiftir. Amacı, spesifik olmayan antikor bağlanmasını en aza indirmektir. Kullanılacak antikorların belirlenmesi, deneyde test edilen hipoteze bağlı olacaktır ve literatürden gelen girdilerle seçilmelidir. Şekil 1'de, genel bağışıklık hücresi infiltrasyonunu ölçmek için, bir pan-bağışıklık hücre proteini olan bir anti-CD45 antikoru kullanılmıştır.
8. Numuneleri 200 x g, 4 °C'de 7 dakika santrifüjleme ile yıkayın. Hücre peletlerini 200 μL akış sitometrisi tamponunda yeniden süspanse edin ve numuneleri bir akış sitometresinde alımdan hemen önce 5 ml'lik bir polistiren tüp üzerinde 40 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin.
9. Tüm numuneyi akış sitometresinde toplayın. İyi bir sindirim, saf fare mesanelerinden 8.000 - 10.000 CD45⁺ bağışıklık hücresi ile 200.000 - 400.000 hücre verirken, enfekte organlar daha fazla hücre içerecektir (Şekil 1).
   not: Flow sitometrik analiz için hazırlanan örnekler CFU'yu değerlendirmek için kullanılamaz. Üropatojenik E. coli (UPEC) kolonizasyonunun veya bağışıklık hücresi infiltrasyonunun doku boyunca homojen olduğunu gösteren hiçbir kanıt bulunmadığından mesanenin iki parçaya ayrılması önerilmez.

Sonuçlar

Şekil 1: İYE'ye Yanıt Olarak Dişi Farelerde İmmün Hücre İnfiltrasyonu Artar. Altı ila sekiz haftalık dişi ve erkek C57Bl / 6 farelere 10⁷ CFU UPEC aşılandı veya aşılanmadı. Temsili nokta grafikleri, saf veya enfekte farelerden pembe renkte kapılı CD45⁺ bağışıklık hücrelerine sahip toplam mesane hücrelerini gösterir. Grafik, saf veya 24 saatlik enfekte farelerden ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Şırınga	B Braun	9166017V
Başparmak (Adson) forseps	Güzel Bilim Araçları	11006-12
5 mL tüpler, polipropilen	doğan	352063
Doku Ruptor tek kullanımlık problar	Keçi	990890
15 mL kapaklı tüpler	Termo Bilimsel	362694
DNAse	Canlandırıcı	18047019
100 μM MACS Akıllı Süzgeçler	Miltenyi	130-098-463	15 mL tüplerle uyumludur, tercih edilir
100 μm hücre süzgeçleri	doğan	352360	MACS Akıllı Süzgeçler mevcut değilse 50 mL'lik tüplerle uyumludur
96 kuyulu plaka	doğan	353077
Fc bloğu	BD Pharmingen	553142	Anti-CD16 / CD32
Anti-fare CD45 antikoru	BD Biyolojik Bilimler	561487	Birçok farklı floresan konjugasyon seçeneği mevcuttur
Filtre kapaklı 5 mL tüp polistiren	doğan	352235
El tipi homojenizatör	Keçi	9001272	DokuRuptor
Akış sitometresi	BD Biyolojik Bilimler	Yok	Fortessa SORP
Akış sitometrisi yazılımı	BD Biyolojik Bilimler	Yok	primadonna