İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Organ Kültürü Plaklarının Hazırlanması
>NOT: Aşağıdaki adımlar bir doku kültürü başlığında steril teknik kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Diseksiyon mikroskobunun steril bir alana yerleştirilmesi idealdir. Bununla birlikte, mikro diseksiyon hızlı bir şekilde yapıldığı ve aletler sıklıkla% 70 etanole batırıldığı sürece bu kesinlikle gerekli değildir.
- Hücre dışı matris (ECM) şişelerini buz üzerinde çözdürün. ECM 1:1'i buz gibi soğuk Toplama ortamıyla seyreltin ve pipetleyerek karıştırın. Kabarcıkların girmesini önlemek için yavaşça pipetleyin. 6 oyuklu bir doku kültürü plakasının her bir oyuğu, bu süspansiyondan 100 μl gerektirir ve 3-4 organ kültürünü barındıracaktır.
- Transwell eklerini (gözenek boyutu 0.4 μM) 6 oyuklu doku kültürü plakasının her bir oyuğuna yerleştirin.
- Her bir transwell ek parçasını ince bir ECM/medya süspansiyonu tabakası (100 μl) ile kaplayın.
- Plakayı buzun üzerine yerleştirin ve hemen organ kültürlerinin kurulmasına devam edin. Alternatif olarak, doku toplamadan önce plakayı hazırlayın, bu durumda para-filme sarın ve daha sonra kullanmak üzere 4 ° C'de saklayın. ECM kuruyacağı için 6 saatten daha uzun süre saklanması önerilmez.
2. Organ Kültürlerinin Kurulması
>NOT: Bu adım, yaprak döken organ kültürlerinin ve villöz organ kültürlerinin ayrı transwell'lere nasıl yerleştirileceğini açıklar. Dokular temas halinde değildir. Desidua ve villusun birbiriyle doğrudan temas halinde olduğu bir ko-kültür tekniğiyle ilgilenen araştırmacılar önceki literatüre başvurabilirler.
- Numuneleri Toplama ortamında iki kez durulayın ve her durulama arasında 1.000 x g'da santrifüjleyin. Dokuyu steril bir petri kabına aktarın ve bir diseksiyon mikroskobu aşamasına yerleştirin. Mikroskobun yanındaki buz üzerinde 6 oyuklu bir plaka bulundurun.
- Steril yaylı diseksiyon makası ve forseps ile dokuyu mikrodiseke ederek 2-3 mm villöz organ kültürleri oluşturun (Şekil 1A).
not: Villöz organ kültürleri, 2 veya 3 dallı ve belirgin ekstravilöz trofoblast (EVT) hücre kolonlarına sahip küçük, iyi vaskülarize "ağaçlar" dır. Ekstravillöz trofoblastların ECM'ye invazyonu en çok bu genç yaşlarda belirgin olduğundan, <9 haftalık ilk trimester örneklerinden sadece villöz doku kullanmak önemlidir.
- Belirgin EVT hücre kolonları olan iyi vaskülarize villusları seçin. EVT hücre sütunları soğanlı, "bulanık", "kabarık" uçlar olarak görselleştirilir (Şekil 1A'daki ok uçlarına bakın).
- Her bir transwell'e 3 veya 4 villus ağacı aktarmak için steril forseps kullanın. Dalları, ağaç ECM'nin üzerine düz bir şekilde yerleştirilecek şekilde ayarlayın ve topaklanmış dalları ayırın.
- 3 mm3 yaprak döken organ kültürü oluşturmak için steril yaylı diseksiyon makası ve forseps ile desidual dokuyu mikro-diseksiyon (Şekil 1A).
not: Örnekler, decidua parietalis ve decidua capsularis olmak üzere iki farklı yaprak döken doku türü içerir (sırasıyla sol ve sağ doku parçaları, Şekil 1A).
- 3 mm3 adet decidua parietalis oluşturmak için makasla kesin. Decidua capsularis bu kültürler için kullanılmaz. Pıhtılaşmış anne kanını uzaklaştırmak için forseps kullanın.
- Her bir transwell'e 3-4 parça desidua aktarmak için steril forseps kullanın.
- Kuyu dibine 1 ml Toplama ortamı ekleyin. Plakayı gece boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 içinde inkübe edin.
- Normal ilk trimester plasental oksijen tansiyonunu taklit etmenin önemli olduğu deneyler için, villöz organ kültürlerini nispi hipokside (% 3 O2) koruyun.
not: Laboratuvar seçenekleri, mevcut inkübatörlerin içine sığan küçük hipoksi inkübatör odalarını veya daha düşük oksijen konsantrasyonuna harici N2 gazı veren bir tri gaz inkübatörünü içerir.
- 12-16 saatlik kültürden sonra transwell'in üstüne 1 ml Villous veya Decidual medium (Tablo 1) ekleyin.
not: Kültürdeki ilk gece boyunca ortamın olmaması, ekstravilöz trofoblast hücre kolonlarının istila etmesine (villöz kültür) ve dokunun (hem villöz hem de yaprak döken) ECM'ye güvenli bir şekilde gömülmesine izin verir. Deneyimlerimize göre, yaprak döken organ kültürleri 72 saat ve villöz organ kültürleri 96 saat boyunca canlı kalmaktadır. Bu zaman dilimine denk gelen deneysel uç noktaları öneririz. Villous ve Decidual ortamın bileşimi için Tablo 1'e bakınız. Villöz besiyeri yüksek bir FBS yüzdesine sahipken, Desidual besiyeri, desidualize durumu koruyan gebelik hormonları (progesteron, 17β-estradiol) ile desteklenir (Tablo 1).
3. L. monocytogenes Kültürlerinin Hazırlanması
>NOT: L. monocytogenes'in uzun süreli depolanması ve bu organizmanın beyin kalp infüzyonu (BHI) suyu ve agarında kültürü ve büyümesi hakkında ayrıntılı bir protokol için lütfen Wang ve ark.'ya bakın.
- Çizgili bir BHI agar plakasından tek bir L. monocytogenes kolonisi seçin ve 3 ml BHI suyunu aşılayın.
- L. monocytogenes kültürünü gece boyunca (16 saat), eğimli bir pozisyonda, 30 ° C'de inkübe edin.
not: Bu kültür koşulları, bakteri üremesinin durağan faza ulaşmasına izin verir. L. monocytogenes 30 °C'de kamçılanır, bu da konak hücre istilasını arttırır.
4. Organ Kültürlerinin L. monocytogenes ile Enfeksiyonu
- Sıcak fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ve Villous veya Desidual ortam (Tablo 1) ila 37 °C.
- ECM'yi istila etmeyen ve bu nedenle kuyuda yüzen organ kültürü parçalarını çıkarmak için steril cımbız kullanın.
- Ortamı transwell'in altından dikkatlice aspire edin. 1 ml ılık PBS'yi kuyuya nazikçe pipetleyerek ve aralarında dikkatlice aspire ederek üst ve alt transwell'leri iki kez durulayın. 1 ml antibiyotik içermeyen Villous veya Decidual besiyerini üst ve alt transwell'e nazikçe pipetleyin. Organ kültürünü bozmamaya dikkat edin.
- Antibiyotiklerin çıkarıldığından emin olmak için dokunun antibiyotiksiz ortamda en az bir saat inkübe etmesine izin verin.
not: Durağan fazda, L. monocytogenes kültürünün yoğunluğu ml başına yaklaşık 1 x 109 koloni oluşturan birimdir (CFU). Organ kültürlerini enfekte etmek için kullanılan bakteri sayısı, deneysel ihtiyaçları karşılamak için ampirik olarak belirlenmelidir.
- Yabani tip L. monocytogenes için rutin enfeksiyon deneyleri, gece boyunca 1:50 seyreltme ile sağlam istila gösterir (kuyucuk başına 1 ml ortamda 4 x 107 L. monocytogenes). Uygun sayıda bakteriyi antibiyotik içermeyen Villous veya Decidual bir ortamda yeniden süspanse edin.
- Transwell'lerin tepesinden ortamı aspire edin. Yavaşça 1 ml inokül ekleyin. Bakteri istilasına izin vermek için plakaları 37 ° C'de% 5 CO2 içinde inkübe edin.
- Üst ve alt transwell'lardan ortamı aspire ederek hücre dışı bakterileri uzaklaştırın. Kuyuları ılık PBS ile iki kez durulayın. 50 μg ml-1 Gentamisin ile desteklenmiş 1 ml Villous veya Decidual media ekleyin. Plakaları 37 °C'de %5 CO2.
içinde inkübe edin
NOT: L. monocytogenes, hücre dışı bir ortamda büyüyebilen, hücrelerin içinde büyüyebilen ve hücre dışı boşluğa erişmeden hücreden hücreye yayılabilen fakültatif bir hücre içi bakteridir. Gentamisin, hücre dışı L. monocytogenes üzerinde bakterisidal bir etkiye sahiptir ve bu nedenle hücre içi L. monocytogenes büyümesinin ölçülmesine ve organ kültürü yoluyla yayılmasına izin verir.
not: Villöz ve desidua organ kültürlerinin tekrarlanabilir L. monocytogenes enfeksiyonu 5 saatlik inkübasyon süreleri ile ortaya çıkar. Gentamisin ilavesinden önceki inkübasyon süresi, deneysel ihtiyaçlara ve organizmanın dokuyu istila etme kabiliyetine bağlı olarak değiştirilebilir. Enfeksiyona karşı en savunmasız anatomik bölgeleri daha iyi anlamak için daha kısa kuluçka süreleri kullanılabilir.
- Deney süresince plakaları %5 CO2 içinde 37 ° C'de tutun. Her kuyucuktaki tüm ortamı günlük olarak değiştirin.
not: Deneyimlerimize göre, L. monocytogenes ile enfekte olmuş desidual organ kültürleri 48 saat, villöz organ kültürleri ise 72 saat canlı kalmaktadır.
Tablo 1: Medya tarifleri. Yıkama tamponu, Toplama ortamı, Vanilya ortamı ve Desdik ortamın hazırlanması için bileşenler ve konsantrasyonlar
| Yıkama tamponu | Toplama ortamı | Villöz orta | Yaprak döken orta |
| Pbs | GlutaMAX ile DMEM/F-12 | GlutaMAX ile DMEM/F-12 | GlutaMAX ile DMEM/F-12 |
| Penisilin 100 IU/ml | Fetal Sığır Serumu %2.5 | Fetal Sığır Serumu %20 | Fetal Sığır Serumu %2.5 |
| Streptomisin 100 μg/ml | Penisilin 100 IU/ml | Penisilin 100 IU/ml | 17β-estradiol 300 pg/ml |
| Gentamisin 50 μg/ml | Streptomisin 100 μg/ml | Streptomisin 100 μg/ml | Progesteron 20 ng/ml |
| Amfoterisin B: 1.25 μg/ml | Gentamisin 50 μg/ml | | |
| Amfoterisin B: 1.25 μg/ml | | |
