Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
DİKKAT: İnsan kan örnekleri ve insan sıtma parazitleri ile çalışmak ihtiyati tedbirler gerektirir. Daima laboratuvar önlüğü ve eldiven giyin ve 2. seviye Biyogüvenlik kabininde çalışın. İnsan sıtmasına kazara perkütan maruz kalma durumunda, profilaktik tedavi için Sağlık ve Güvenlik'e rapor verin. İnsan immün yetmezlik virüsü HIV (+) kanı ile çalışmak için ek güvenlik hususları da uygulanmalıdır. Arkaya kapanan bir laboratuvar önlüğü giyin. Çift eldiven (üst eldiven lateks olmalıdır). Tüm işlemleri seviye 2 Biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin. Herhangi bir cam veya keskin nesneler kullanmayın. Aspiratör kullanmayınız. Kirlenmiş tüm maddeleri, atmadan önce en az 1 saat boyunca virox solüsyonuna veya ağartıcıya koyun. Kullanımdan sonra tüm yüzeyleri 1 saat boyunca virox ve ultraviyole (UV) ile yıkayın. Her kurumun uyulması gereken kendi özel biyogüvenlik yönetmeliklerine sahip olacağını unutmayın. HIV ile enfekte kana kazara maruz kalınan tüm maruziyetleri, olası maruziyet sonrası profilaksinin değerlendirilmesi ve değerlendirilmesi için Sağlık ve Güvenlik'e bildirin.
Not: P. falciparum sıtma parazitlerinin farklı türleri mevcuttur. Bu deneyler için ITG kullanıldı, ancak farklı suşlar da kullanılabilir. Plasmodium falciparum parazitlerinin dondurulması ve çözülmesi ile ilgili mükemmel talimatlar MR4 web sitesinde mevcuttur.
1. Sıtma Parazit Kültürü için RPMI-A Yapımı
- 950 ml çift damıtılmış su (ddH2O), 1 paket Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 tozu, 6 g N-2-hidroksietilpiperazin-N-2-etan sülfonik asit (HEPES), 2 g sodyum bikarbonat ve 1.35 mg hipoksantini karıştırarak RPMI-0 yapın.
- İki farklı donörden ısıyla etkisiz hale getirilmiş insan serumunu çözün. AB donörleri en iyisidir, ancak parazitler O-tipi kırmızı kan hücrelerinde (RBC) büyürse herhangi biri kullanılabilir. Karıştırmak için tüpleri ters çevirin. Serum partikül madde içeriyorsa veya kalınsa, 2.000 rpm'de döndürün ve ardından sıvı kısmı 0.45 μm'lik bir filtre ünitesi kullanarak filtreleyin.
- 0.2 μm'lik bir filtre ünitesi kullanarak 180 ml RPMI-0, 20 ml insan serumu (her donörden 10 ml) ve 0.5 ml 10 mg / ml gentamisin.
not: İnsan serumu filtreyi tıkayabilir, bu nedenle birden fazla filtre ünitesi gerekebilir.
- Orta boy şişeyi RPMI-A, tarih ve serumun kaynağı ile etiketleyin. Gerekene kadar soğutun. RPMI-A soğutulduğunda bulanıklaşabilir. Bu normaldir, ancak artan bulanıklık bir kontaminasyon belirtisidir.
not: Parazit büyümesi farklı donör serumlarında farklılık gösterebilir. Kullanmadan önce tüm insan serum partilerini iyi parazit büyümesi açısından test etmek iyi bir fikirdir.
2. İnsan Kırmızı Kan Hücrelerinin Parazit Kültürü için Hazırlanması
Not: Kan bağışçıları O tipi olmalıdır.
- 7-10 ml kanı asit-sitrat-dekstroz (ACD) tüplerine toplayın. Etikete bağışçının kimliğini ve teslim alma tarihini yazın.
- İhtiyaç duyulana kadar kanı 4 ° C'desaklayın. Parazit kültürleri için 1 ay içinde kan kullanın.
- Tüpün üst kısmını% 70 etanol ile silin. Durdurucuyu dikkatlice çıkarın ve atın. Kanı 15 ml'lik bir tüpe aktarın. 1.000 x g'da 3 dakika döndürün. Plazmayı aspirasyon ile çıkarın.
- RBC'yi eşit hacimde ılık RPMI-0 ile askıya alın. 1.000 x g'da 5 dakika döndürün. Buffy ceketi aspirasyon ile çıkarın, 5 ml RPMI-0'da tekrar süspanse edin ve yıkamayı 2 kez daha tekrarlayın.
- Süpernatanı çıkarın ve hacimce %50 RBC olan bir karışım elde etmek için yeterli RPMI-A ekleyin.
- İhtiyaç duyulana kadar 4 ° C'desaklayın.
3. Parazit Kültürlerinin Bakımı
- 37 oC'ye kadar ön ısıtma RPMI-A.
- Çözülmüş parazitleri (çözme prosedürü için MR4 protokolüne bakınız) ~% 3'lük bir hematokrit için 5 ml RPMI-A ve 75 μl yıkanmış insan RBC'si içeren bir T25 şişesine yerleştirin. not: Hematokrit, toplam hacme kıyasla RBC hacmini ölçer. Hematokrit'i hesaplamak için, paketlenmiş RBC'nin hacmini ortam artı RBC'nin toplam hacmine ölçün. Çözülmüş parazitlerin 75 μl RBC'ye katkıda bulunacağını varsayalım. Şişeye 150 μl RBC stoğu (75 μl paketlenmiş RBC eklemeye eşdeğerdir) eklenerek, 5 ml ortamda toplam 150 μl RBC bulunur, bu da %3'lük bir hematokrite eşittir (150 μl/5.000 μl x %100 = %3).
- Şişeyi 30 saniye boyunca parazit gaz karışımı ile gazlayın (% 1 O2,% 3 CO2, denge N2). Gaz değişimi için en büyük yüzey alanını sağlamak için şişeyi geniş tarafı aşağı bakacak şekilde 37 oC'lik bir inkübatöre kapatın ve yerleştirin.
- Ortamı değiştirmek ve parazitemi olup olmadığını kontrol etmek için (günlük olarak yapılması gerekir), RBC tabakasını rahatsız etmeyecek şekilde şişeyi dikkatlice hareket ettirin. Steril, fişi çekilmeyen bir Pasteur pipeti kullanarak, kan tabakasını rahatsız etmeden kültür ortamını çekin.
- Parazitemiyi kontrol etmek için, kan tabakasından 10 μl'lik bir numune alın, bir cam slayt üzerine yerleştirin ve ikinci bir cam slayt kullanarak ince bir kan filmi oluşturun. Slaytın kurumasını bekleyin.
- Şişeye 4 ml taze RPMI-A koyun, hafifçe karıştırın, 30 saniye gaz verin ve 37 °C'de bir inkübatöre koyun.
- Üreticinin protokolüne göre Hema3 boyama kitini kullanarak slaytı boyayın.
- Optimum boyama için, slaytları sabitleme solüsyonuna 10 saniye, solüsyon I'e 10 saniye ve çözelti II'ye 30 saniye batırın. Suyla durulayın ve slaytları kurumaya bırakın.
- Plasmodium falciparum RBC, PfRBC (lekeli koyu mor) sayısını toplam RBC sayısına (lekeli pembe) karşı sayarak parazitemiyi hesaplayın. Doğruluğu sağlamak için toplam 300 hücre sayın.
- Parazitler% 5'lik bir parazitemiye ulaştığında, kültürü 40 ml RPMI-A ve 500 μl RBC kullanarak bir T75 şişesine genişletin.
4. Parazit Senkronizasyonu
Not: Deneyden bir gün önce, parazit kültürünü alanin ile tedavi ederek senkronize edin. Sadece halka evreli parazitler ve enfekte olmamış eritrositler bu tedaviden kurtulabilir. Alanin senkronizasyonu, ertesi gün size ko-kültür deneylerinde kullanılabilecek saf bir trofozoit kültürü verecektir. Halka evresi parazitlerin çoğunu içeren bir parazit kültürüyle başladığınızdan emin olun.
- 8.01 g alanin (300 mM) ve 0.365 g Tris (10 mM) 300 ml ddH2O içine karıştırarak alanin çözeltisi hazırlayın. pH'ı 7.4'e getirin. Filtre, 0,2 μm filtre ünitesi kullanarak sterilize edilir.
- Alanin çözeltisini 37 ° C'yeönceden ısıtın.
- Parazit kültürünü (5 dk x 1.000 x g) döndürün ve ortamı çıkarın.
- Peleti 19 hacim alanin çözeltisinde (1 ml paketlenmiş RBC ila 19 ml alanin çözeltisi) yeniden süspanse edin. Oda sıcaklığında (RT) 15 dakika inkübe edin.
- Sıkma 5 dk x 1.000 x g. Aspirat süpernatanı. RPMI-0'da bir kez yıkayın. Süpernatanı aspire edin ve RPMI-A'da yeniden süspanse edin ve hematokrit'i ~% 3'e ayarlayın. Gaz şişesi ve 37 oC'ye geri dönün.
not: Ko-kültür deneyleri için, minimum% 5 trofozoitlik bir parazitemi gereklidir,% 10 parazitemi optimal olarak kabul edilir.
5. Ko-kültür Deneyleri için Parazit ve RBC Hazırlığı
- Enflamatuar bir yanıtı indüklemek için ko-kültür deneylerinde PBMC başına 3 PfRBC oranı kullanın. Toplam PfRBC'yi hesaplamak için, 3.5'te tarif edildiği gibi ince bir kan yayması yaparak parazitemiyi ve bir hemositometre kullanarak parazit kültürünün mL'si başına RBC sayısını sayarak hematokrit'i ölçün.
PfRBC sayısı =% parazitemi x toplam RBC/ml x ml kültür. Örneğin, 10 x 106 RBC/ml'de 10 ml kültür ve% 10 parazitemi, 0.1 x 106 / ml x 10 ml = 10 x 106 PfRBC'ye eşittir.
- Parazit kültürünü 1.000 x g'da (RT) 5 dakika döndürün. Ortamı aspire edin ve RPMI-S + (L-glutamin ve HEPES ile desteklenmiş 500 ml RPMI-1640,% 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS), 1.5 ml gentamisin, 5 ml 100 mM sodyum piruvat, 5 ml 10 mM MEM esansiyel olmayan amino asitler, 5 ml 5mM β-merkaptoetanol) içinde ml başına6 x 10 6 PfRBC'de yeniden süspanse edin.
- Kontrol kanı alın (parazit kültürünü korumak için kullanılan aynı donörden enfekte olmamış RBC), hematokrit'i hesaplayın ve parazit kültürü ile ml başına aynı sayıda RBC'de RPMI-S + 'da yeniden süspanse edin.
>6. İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin (PBMC) İzolasyonu
- Hem kronik HIV (+) donöründen hem de HIV (-) kontrolünden sodyum heparin tüplerinde (yeşil üst) venöz kan toplayın. EDTA'nın kalsiyum şelatlayıcı etkisi hücre fonksiyonunu etkilediğinden, Etilendiamintetraasetik asidi (EDTA) pıhtılaşma önleyici olarak kullanmayın. Ortalama olarak, 10 ml kan başına 5-10 x 106 PBMC arasında bekleyin. Tipik bir deney için, her donörden 30 ml kan toplayın. Kan hacminin deneysel gereksinimlere göre ayarlanması gerekecektir.
- Mümkün olan en kısa sürede ve kesinlikle kan alındıktan sonraki bir saat içinde, kanı tüplerden çıkarın ve 50 ml'lik plastik bir tüpe koyun. Özellikle monositler aktive olacak ve cama yapışacaktır, bu nedenle cam kan alma tüpleri kullanılıyorsa hücrelerin mümkün olduğunca çabuk çıkarılması önemlidir.
- Kanı 15 dakika boyunca 1.000 x g'da döndürün ve plazma toplayın (bu, gerekirse diğer çalışmalar için kullanılabilir - aksi takdirde bu adım atlanabilir). Kanı eşit miktarda soğuk Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS) ile seyreltin.
- 15 ml RT Ficoll'u 50 ml'lik bir tüpe yerleştirin. Yavaşça, steril bir plastik transfer pipeti kullanarak, kan / DPBS çözeltisini herhangi bir karıştırma olmadan Ficoll üzerine katmanlayın. Her 15 ml Ficoll'un üzerine maksimum 25 ml kan / DPBS çözeltisi katmanlanabilir.
- Degradeleri RT'de 600 x g'da 30 dakika döndürün. 'Fren yok' ayarının açık olduğundan emin olun.
- Hücreler döndürüldükten sonra, iki faz arasındaki arayüzü arayın. PBMC'lerin olduğu yer burasıdır. Steril bir plastik transfer pipeti kullanarak PBMC'yi arayüzden toplayın (bkz. Şekil 1). RBC ile kontaminasyonu en aza indirin.
- Toplanan hücreleri, tüp başına 20 ml'den fazla olmayacak şekilde 50 ml'lik tüplere yerleştirin. Steril soğuk DPBS ile 50 ml'ye kadar üst tüp.
- Hücreleri 4 °C'de 300 x g'da 10 dakika döndürün.
- Süpernatanı atın, peleti 5 ml steril soğuk DPBS'de yeniden süspanse edin ve aynı donörden gelen tüm hücreleri tek bir tüpte toplayın. Steril DPBS ile 50 ml'ye kadar doldurun ve yıkama adımlarını 2 kez daha tekrarlayın.
- Hücreleri 10 ml RPMI-S+ ortamında yeniden süspanse edin.
- 20 μl'lik bir alikotu çıkarın ve 20 μl tripan mavisi ile karıştırın. Bir hemositometreye 10 μl pipetleyin ve canlı hücreleri sayın (mavi boyayı almayan hücreler - tüm mavi hücreler ölmüştür). Bir çözeltideki hücre sayısını aşağıdaki gibi hesaplamak için bir hemositometre kullanın.
not: Bir hemositometre, çizgilerin kapladığı alanın bilinmesi için belirli boyutlarda bir ızgaraya sahiptir.
- Hemositometrenin temiz olduğundan emin olun. Lameli sayma alanının üzerine yerleştirin. Pipet ucunu V şeklindeki oyuklardan birine yerleştirerek 10 μl hücre çözeltisi yükleyin. Lamelin altındaki alan kılcal hareket ile doldurulacaktır.
- Yüklü hemositometreyi mikroskop altına yerleştirin. Hemositometrenin tam ızgarası, her biri 1 mm2'lik 9 kare içerir. Her büyük karenin içindeki tüm hücreleri sayın. Çok fazla hücre varsa, çözeltiyi daha fazla seyreltin ve yeniden sayın.
- Hücre konsantrasyonunu aşağıdaki gibi hesaplayın: Toplam hücre/ml = (sayılan toplam hücre/# kare) x seyreltme faktörü x 10.000 hücre/ml, örneğin, (500 hücre/5 kare) x 20 x 10.000 hücre/ml seyreltme faktörü = 20 x 106 hücre toplam.
- Ortamı ml başına 10 x10 6'lık bir nihai konsantrasyona ayarlayın (RPMI-S+ ortamı).
7. Sıtma/HIV Ko-enfeksiyon Kültürü
- Plaka: 100 μl izole PBMC'ler ve 400 μl RPMI-S+ ortamı 24 oyuklu bir plakaya (kuyucuk başına 1 x 106 PBMC). Kuyuların üç nüsha halinde kurulduğundan emin olun: enfekte olmamış RBC için 3 kuyu, PfRBC ile 3 kuyu, orta ile 3 kuyu ve PMA/İyonomisin ile 3 kuyu. Bu hem HIV (+) hem de HIV (-) örnekleri için geçerlidir.
- PfRBC kuyuları için, kuyucukların her birine 3 x 106 PfRBC yerleştirin (5.2'de hazırlanan 500 μl parazit kültürü).
- Enfekte olmamış RBC kuyucukları için, oyukların her birine 5.3'te hazırlanan enfekte olmamış RBC kültüründen 500 μl yerleştirin.
- Orta kuyular için, kuyucukların her birine 500 μl RPMI-S+ ortamı yerleştirin.
- PMA/İyonomisin kuyuları için PMA/İyonomisin çözeltisi hazırlayın (sırasıyla 2.5 pg/ml, 250 pg/ml). Her bir kuyucuğa bu çözeltiden 500 μl yerleştirin.
not: T hücresi sitokin sekresyonunun güçlü uyarıcıları olarak, PMA ve İyonomisin, hücrelerin işlevsel olmasını sağlamak için pozitif kontroller olarak kullanılır.
- Plakayı 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatöre yerleştirin.
- İsteğe bağlı: akış sitometrisi kullanarak fenotipik analiz için fazla hücre kullanın veya gelecekteki mRNA ekspresyon analizi için bunları bir RNA stabilizasyon solüsyonunda saklayın.
8. Sıtma Bağışıklık Yanıtlarının Tespiti
Not: 4 gün boyunca ortak kültür deneyleri gerçekleştirin. Bu süre zarfında herhangi bir orta değişiklik gerekmez. En uygun zaman noktası, ilgilenilen hücre türüne ve sorulan soruya bağlı olacaktır. PfRBC'lere monositik yanıtlar için 12-48 saatlik bir inkübasyon optimal iken, lenfosit yanıtları en iyi 72-96 saatte gözlenmiştir. Zaman noktalarının deneysel soruya göre optimize edilmesi gerekecektir. Bozulmamış PfRBC ve PBMC'ler arasındaki etkileşim ilgi çekiciyse, daha kısa süreler (2-4 saat) kullanılabilir.
- Pelet hücrelerine 3 dakika boyunca 300 x g'da döndürün. Her oyuktan 700 μl kültür süpernatanı toplayın.
- Herhangi bir kalıntıyı temizlemek için süpernatanı 5 dakika boyunca 1.000 x g'da döndürün.
- Aliquot süpernatanı gerektiği gibi temizledi, etiketledi ve salgılanan faktörlerin analizi yapılana kadar -20 ° C'nin altında dondurun.
