Allojenik Kemik İliği ve Splenik Hücre Nakli ile Fare Modellerinde Graft Versus Host Hastalığının İndüksiyonu

Özet

Kaynak: Buchele, V., et al. Canlı Farelerde Bağırsak Greft-versus-host Hastalığının İndüksiyonu ve Mini-endoskopik Değerlendirmesi. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu video, allojenik hematopoietik kök hücreler ve GvHD'yi indükleyen splenik alloreaktif T lenfositleri kullanılarak letoral ışınlanmış bir alıcı farede bağırsak greftine karşı konak hastalığının (GvHD) indüksiyonunu göstermektedir. Bu protokol, hastalığın mekanizmasını anlamak ve yenilikçi terapötik seçenekler geliştirmek için ciddi bir akut intestinal GvHD modeli oluşturmaya yardımcı olur.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. GvHD indüksiyonu

1. 0. Gün: Alıcı farelerin toplam vücut ışınlaması
   1. Alıcı olarak en az 10 haftalık olan dişi CD45.2 + H2kd + BALB / c fareleri kullanın.
   2. GvHD indüksiyonundan önce alıcı farelerin ağırlığını tartın ve kaydedin.
      not: Alıcının minimum vücut ağırlığının 20 g olduğundan emin olun. Başlangıç vücut ağırlığı, GvHD indüksiyonu ve ilerlemesi boyunca her bir farenin ağırlık kaybını hesaplamak için referans değer görevi görecektir.
   3. X-ışını ışınlayıcısının kabına en fazla beş fare yerleştirin.
   4. Fareleri, tek bir doz 8 Gy X-ışını ile toplam vücut ışınlaması ile ışınlayın. Cs137'yi radyasyon kaynağı olarak kullanın.
2. 1. Gün: Işınlanmış farelerin T hücresi tükenmiş kemik iliği ile sulandırılması
   not: Allojenik kemik iliği hücrelerinin transplantasyonu, bölüm 1.2'de belirtildiği ve detaylandırıldığı gibi, ışınlamadan sonraki 24 saat içinde yapılmalıdır. Aşağıda açıklanan prosedürleri steril bir doku kültürü başlığında gerçekleştirin ve filtrelenmiş reaktifler kullanın. Allojenik CD45.1 / Ly5.1 B6 kullanın. T hücresi tükenmiş kemik iliği için donör olarak SJL-Ptprca Pepcb/BoyCrl fareleri.
   1. CD45.1 / Ly5.1 B6'yı ötenazi yapın. Allojenik kemik iliği hücrelerini kurumsal yönergelere uygun olarak bağışlayacak SJL fareleri, alıcı BALB/c farelerinin ışınlanmasından 12-24 saat sonra. Bunun için CD45.1 / Ly5.1 B6'yı uyuşturun. % 5 izofluran solunarak SJL fareleri. Solunum durmasından sonra 1 dakika boyunca izofluran maruziyetine devam edin ve servikal çıkık ile ötenaziyi onaylayın.
   2. Farenin kürkünü ve derisini% 70 etanol ile iyice dezenfekte edin.
   3. Fareyi, arka tarafı deneyciye bakacak şekilde yüzüstü pozisyonda olacak şekilde temiz bir çalışma kılıfının üzerine yerleştirin. Aşil topuğundaki kürkü, 13 cm uzunluğunda ve tırtıklı kavisli uçlara sahip Semken forsepslerinin ucuyla kaldırın. Düz uçlu sertleştirilmiş 8,5 cm ince makasla forseps ile topuk arasındaki cildi kesin.
   4. Kesiği kraniyal olarak uzatın (yani, topuktan alt bacak ve uyluk üzerinden kalça bölgesine). Forseps yardımıyla arka bacaktan deriyi ve kürkü çıkarın.
   5. Aynı işlemi diğer arka bacakta da uygulayın.
   6. Bitişik kalça eklemlerini keserek arka bacakları çıkarın.
   7. Arka pençeleri kesin. Diz eklemini kesin. Her arka uzuvun uyluğunu ve sapını buz üzerinde fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisi ile doldurulmuş 92 mm'lik bir Petri kabında bir arada saklayın.
   8. Her uyluk ve saptan mümkün olduğunca fazla kas dokusu çıkararak femur ve tibia kemiklerini dikkatlice temizleyin. Femur ve tibia kemiklerini steril RPMI 1640 besiyeri ile doldurulmuş 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve adım 1.2.7'de toplanan tüm tibia ve femur kemikleri kas dokusundan temizlenene kadar ıslak buz üzerine yerleştirin.
   9. Kemik iliğini izole etmek için, her seferinde bir femur veya tibia kemiğini (adım 1.2.8'de tarif edildiği gibi temizlenmiş) 50 mL'lik tüpten RPMI 1640 ortamı ile doldurulmuş bir Petri kabına (92 mm çapında) aktarın. Kemik iliğini içeren kemiğin boşluğuna erişmek için uyluk kemiğinin veya tibianın uçlarını bir neşterle kesin.
   10. 5 mL RPMI 1640 ortamı ile 50 mL'lik bir toplama tüpü hazırlayın. 1 mL RPMI 1640 ortamı ile doldurulmuş 1 mL'lik bir şırıngaya bağlı 26 G'lik bir iğneyi kemik boşluğuna yerleştirin ve pistonu iterek kemik iliğini boşluktan toplama tüpüne akıtın.
   11. Kemik açık ve parlak görünene kadar (yani, kemik boşluğu gözle görülür şekilde kırmızımsı kemik iliğinden yoksun) 1.2.10 adımını tekrarlayın. Boş kemiği atın.
   12. Adım 1.2.8'deki tüm femur ve tibia kemiklerini kullanarak 1.2.9 - 1.2.11 adımlarını tekrarlayın ve geri kazanılan tüm kemik iliği parçalarını adım 1.2.10'daki aynı 50 mL toplama tüpünde toplayın. Adım 1.2.8'deki tüm kemikler uygun şekilde işlenene kadar toplama tüpünü ıslak buz üzerinde tutun.
   13. Yıkanmış, ufalanan kemik iliği parçalarını yukarı ve aşağı yumuşak bir şekilde pipetleyerek tek hücreli bir süspansiyon oluşturun. Kemik iliği tek hücreli süspansiyonunu, yeni bir 50 mL toplama tüpüne yerleştirilmiş 40 μm'lik bir elek elek hücre süzgecinden süzün.
   14. Kemik iliği tek hücreli süspansiyonu içeren 50 mL'lik toplama tüpünü 450 x g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
   15. Kırmızı kan hücresi lizizi için peleti 5 mL ACK parçalama tamponunda (1 mM Na²EDTA; 10 mM KHCO₃; 144 mM NH₄Cl; pH 7.2) yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin. Daha sonra, hücre süspansiyonuna hemen 10 mL PBS çözeltisi ekleyin.
   16. Süspansiyonu 450 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri 2 mL PBS çözeltisinde yeniden süspanse edin.
   17. Bir hemositometre kullanarak kemik iliği hücrelerini sayın. Hücre saflaştırmasından sonra hücrelerin saflığını kontrol etmek için akış sitometrisi analizi için 6 x 10⁶ hücreli bir alikotu koruyun (bkz. adım 1.2.20).
   18. Kemik iliği tek hücreli süspansiyonundan T hücrelerinin tükenmesi için, ticari olarak temin edilebilen bir hücre saflaştırma kiti kullanın. Üreticinin protokolünü izleyerek toplam kemik iliği hücrelerinden CD90.2+ hücrelerini (yani lenfositleri) manyetik olarak tüketin.
   19. Bir hemositometre kullanarak adım 1.2.18'de tarif edildiği gibi izole edilen T hücresi tükenmiş kemik iliği hücrelerini sayın. Adım 1.2.20.
       'da açıklandığı gibi, daha sonra gerçekleştirilecek akış sitometrisi analizi için 1 x 106 hücrelik bir alikotu koruyun not: Bir donör fareden elde edilen ortalama hücre verimi genellikle 2 x 107 ila 3.4 x 107 T hücresi tükenmiş kemik iliği hücreleridir.
   20. Akış sitometrisi ile başarılı bir T hücresi tükenmesini onaylayın. Aşağıdaki antikorlarla 1.2.17 (manyetik hücre ayrılmasından önce kemik iliği hücreleri) ve 1.2.19 (manyetik hücre ayrılmasından sonra T hücresi tükenmiş kemik iliği hücreleri) adımlarından korunan 1 x 10⁶ hücreyi boyayın: α-CD45.1 (A20), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) ve α-CD8α (53-6.7). Akış sitometresini ayarlamak için adım 1.2.17'den kalan hücreleri boyanmamış kontrol olarak ve tek boyamalı kontroller için kullanın.
       1. Akış sitometrik boyama prosedürünü gerçekleştirmek için her numuneden 1 x 10⁶ hücreyi V tabanlı 96 oyuklu bir plakanın kuyusuna aktarın.
       2. 96 oyuklu plaka içindeki hücreleri (adım 1.2.20.1) 4 ° C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de döndürün. Süpernatanı atın ve hücreleri 100 μL FACS tamponunda (% 3 filtrelenmiş sığır serumu ile desteklenmiş PBS) yeniden süspanse edin.
       3. 96 oyuklu plaka içindeki hücreleri 450 x g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
       4. 100 μL FACS tamponunda tek boyama için numunelere uygun miktarda tercih edilen antikoru ekleyin (adım 1.2.20 ile karşılaştırın).
       5. Manyetik T hücresi tükenmesinden önce (bkz. adım 1.2.17) ve sonrasında (bkz. adım 1.2.19) korunan kemik iliği hücresi alikotlarını ayrı ayrı boyamak için yeterli miktarları içeren tüm antikorların (ana karışım) bir karışımını hazırlayın. Her iki alikota 100 μL ana karışım ekleyin.
       6. Lekelenmemiş numuneye sadece 100 μL FACS tamponu ekleyin.
       7. 96 oyuklu plaka içindeki hücreleri karanlıkta 4 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
       8. 100 μL FACS tamponu ekleyin ve 96 oyuklu plaka içindeki hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 450 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri 100 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin.
       9. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 450 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri 250 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin.
       10. Numuneleri 5 mL'lik polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın ve bunları, hücre örneklerini karakterize etmek için kullanılan antikorları etiketlemek için kullanılan floresan moleküllerini tespit edebilen bir akış sitometresi cihazı ile analiz edin (bkz. adım 1.2.20).
       11. Manyetik hücre ayrımından önceki ve sonraki hücre bileşimini karşılaştırın.
           not: Canlı geçit içinde yaklaşık% 95 CD45.1 + CD3- (yani, T hücresi tükenmiş kemik iliği) hücrelerinin saflığı genellikle elde edilir.
   21. T hücresi tükenmiş kemik iliği hücresi süspansiyonlarını 2 kez PBS solüsyonu ile yıkayın (4 ° C'de 5 dakika boyunca 450 x g) ve son olarak, hücre konsantrasyonunu 5 x 10⁷ hücre / mL'ye ayarlayarak hücreleri PBS solüsyonunda yeniden süspanse edin. Hücreleri enjeksiyona kadar ıslak buz üzerinde tutun.
   22. T hücresi tükenmiş kemik iliği hücrelerini, bir gün önce ışınlanmış olan alıcı farelere enjekte edin (bkz. bölüm 1.1).
       1. Deney faresini sızdırmaz bir odaya yerleştirin ve fare bilincini kaybedene kadar% 4'e kadar izofluran soluyarak anesteziyi indükleyin. Doğrultma refleksinin kaybını ve ardından pedal çekme refleksinin kaybını test ederek analjezi ve bilinç kaybını onaylayın.
       2. 5 x 10⁶ T hücresi tükenmiş kemik iliği hücresi (ör., 100 μL 5x10⁷ hücre / mL) PBS çözeltisi içeren 1 mL'lik bir şırınga kullanarak intravenöz sinüsü içeren retrobulbar boşluğa intravenöz olarak 30 G iğne ile donatılmış.
3. 2. Gün: T hücrelerinin transferi
   not: Aşağıda açıklanan prosedürleri steril bir doku kültürü başlığında gerçekleştirin ve filtrelenmiş reaktifler kullanın. CD45.2 C57Bl/6 (vahşi tip; WT) alloreaktif T hücreleri için donör olarak fareler. Konjenik belirteç sistemlerinin kullanımı, alıcı (CD45.2+ H2kd+ Balb/c fareleri) ve donör hematopoietik hücre tipleri (kemik iliği hücreleri: CD45.1+ H2kb+ B6) arasında ayırt edilebilirlik sağlar. SJL fareleri; allojenik T hücreleri: CD45.2 + H2kb + C57 / Bl6 fareleri).
   1. C57Bl/6 fareleri, uygulanan kurumsal yönergelere ve yetkililere uygun olarak ötenazi yapın. Bu nedenle,% 5 izofluran konsantrasyonu ile inhalasyon yoluyla fareleri uyuşturun. Nefes alma durmasından 1 dakika sonrasına kadar izofluran maruziyetine devam edin ve servikal çıkık ile ötenaziyi onaylayın. Farenin kürkünü ve derisini% 70 etanol ile iyice dezenfekte edin.
   2. 50 mL'lik bir toplama tüpüne 40 μm gözenekli bir süzgeç yerleştirin. Dalağı çıkarın ve süzgecin üzerine yerleştirin.
   3. Bir şırınga pistonu ile dalağı süzgeçte parçalayın. Tüm splenositleri toplamak için süzgeci ve şırınga pistonunu PBS ile yıkayın.
   4. 50 mL toplama tüpü içindeki hücreleri 450 x g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı atın.
   5. Kırmızı kan hücrelerini parçalamak için splenositleri 3 mL ACK parçalama tamponunda yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 3 dakika inkübe edin. Daha sonra, 10 mL PBS ekleyin ve hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 450 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve splenositleri PBS'de yeniden süspanse edin.
   6. Bir hemositometre kullanarak dalak hücrelerini sayın. Adım 1.3.9'daki saflaştırmanın büyüklüğünü değerlendirmek için akış sitometrisi analizi için 6 x 10⁶ hücreli bir alikotu yönlendirin.
   7. Toplam splenositlerden toplam CD3 + T hücresi izolasyonu için, ticari olarak temin edilebilen bir hücre saflaştırma kiti kullanın. Üreticinin protokolünü takip ederek splenik T hücrelerini izole edin.
   8. Bir hemositometre kullanarak adım 1.3.7'de tarif edildiği gibi izole edilen splenik CD3 + T hücrelerini sayın. Akış sitometrisi analizi için 1 x 10⁶ T hücreli bir alikotu koruyun.
      not: Manyetik hücre ayırma ile izole edilen donör fare başına splenik T hücrelerinin ortalama verimi 1.3 x 10⁷ ila 2 x 10⁷ hücre arasında değişir.
   9. Akış sitometrisi ile T hücresi izolasyonunun başarısını onaylayın. Boyama protokolünün ayrıntılı bir açıklaması için 1.2.20.1 - 1.2.20.10 adımlarını görüşün ve izleyin.
      1. Aşağıdaki antikorlarla 1.3.6 (manyetik hücre ayrılmasından önce) ve 1.3.8 (manyetik hücre ayrılmasından sonra) adımlarının 1 x 10⁶ splenositini boyayın: α-CD45.2 (104), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) ve α-CD8α (53-6.7).
      2. Akış sitometresini ayarlamak için adım 1.3.6'dan kalan hücreleri boyanmamış bir kontrol olarak ve ilgili antikorlarla tek boyama için kullanın.
      3. Manyetik hücre ayrımından önceki ve sonraki hücre bileşimini karşılaştırın.
         not: Lenfosit canlı kapısı içindeki CD45.2 + CD3 + T hücrelerinin% ≥95'i kadar bir saflık elde edilmelidir.
   10. T hücrelerini 2x PBS ile yıkayın (4 ° C'de 5 dakika boyunca 450 x g) ve son olarak, hücre konsantrasyonunu 7 x 10⁶ hücre / mL'ye ayarlayarak hücreleri PBS çözeltisinde yeniden süspanse edin. Enjeksiyona kadar hücreleri buz üzerinde tutun.
   11. Daha önce CD45.1+ T hücresi tükenmiş kemik iliği hücreleri almış ışınlanmış BALB/c farelerine alloreaktif, splenik T hücreleri (bkz. adım 1.3.10) enjekte edin (bkz. adım 1.2.22).
       1. Deney faresini, bilincini kaybedene kadar% 4'e kadar izoflurana maruz kaldığı sızdırmaz bir odaya yerleştirerek anesteziyi indükleyin. Doğrultma refleksinin kaybını ve ardından pedal çekme refleksinin kaybını test ederek analjezi ve bilinç kaybını onaylayın.
       2. 30 G'lik bir iğne ile donatılmış 1 mL'lik bir şırınga kullanarak 0.7 x 10⁶ alloreaktif CD3 + T hücresi enjekte edin (ör., 100 μL 7 x 10⁶ hücre / mL) PBS çözeltisi içeren (bkz. adım 1.3.10), GvHD'yi indüklemek için farelerin retrobulbar boşluğuna intravenöz olarak bu fareleri deneyin.
       3. Tek başına 100 μL PBS ile farklı bir fare grubuna intravenöz olarak retrobulbar boşluğa enjekte edin ve bu grubu daha sonra "T hücresi nakli olmayan (noT) fareler" olarak adlandırılan kontrol grubu olarak adlandırın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
BIOBEAM 2000 Gama Işınlayıcı	Gama-Hizmet Meical GmbH
Fosfat tamponlu salin (PBS)	Sigma-Aldrich Co., LLC.	D8662-6x500ML
Semken Forseps (uzunluk: 13 cm; tırtıklı, kıvrık uçlar)	Güzel Bilim Araçları	11009-13
Sertleştirilmiş İnce Makas (uzunluk: 8,5 cm; düz uçlar; kesici kenar: 24 mm)	Güzel Bilim Araçları	14090-09
RPMI-1640 Orta	Sigma-Aldrich Co., LLC.	R8758-500ML
Hipodermik iğne (26G)	B. Braun Melsungen AG	4657683
1 mL şırınga	B. Braun Melsungen AG	9166017V
50 mL tüp	Sarstedt Ag & Co.KG	6,25,47,254
40 μm gözenekli ekranlı hücre süzgeci	BD Şahin	352340
Steril iç kısımlı insülin şırıngası (30G)	Bd	324826
Pan T Hücre İzolasyon Kiti II, fare	Miltenyi Biotec GmbH	130-095-130	splenik T hücrelerini izole etmek için mıknatıs hücresi ayırma
CD90.2 Mikro Boncuklar, fare	Miltenyi Biotec GmbH	130-049-101	T hücresi tükenmiş kemik iliği hücrelerini izole etmek için mıknatıs hücresi ayırma
Biyopsi Forseps	KARL STORZ SE & Co KG	61071 ZJ	Kolonoskopi için deney düzeneğinin bir parçası
Etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu dihidrat (Na2EDTA)	Carl Roth GmbH & Co.KG	8043.2	ACK parçalama tamponunun içeriği
Alexa Fluor 700 anti-fare CD45.2 Antikoru (klon: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731)	Biyoefsane	109822
PE/Cy7 anti-fare CD45.1 Antikoru (klon: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168)	Biyoefsane	110730
APC/Cy7 anti-fare CD8a Antikoru (klon: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753)	Biyoefsane	100714
Foran / İzofluran	AbbVie Inc.	B506
Filtrelenmiş sığır serumu	Pan Biyotec	P40-47500	FACS tamponunun içeriği