1. C. parvum Ookistlerinden Sporozoitlerin İn Vitro Saflaştırılması
- Yukarıda tarif edildiği gibi ağartıcıyı ağarttıktan ve yıkadıktan sonra sporozoitleri C. parvum ookistlerinden arındırın.
- Ookistleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın. 1 x 107 ookist / mL elde etmek için ookistleri oda sıcaklığında eksitasyon ortamında (DMEM'de% 0.75 w / v sodyum taurokolat) yeniden askıya alın. Taurokolat ilavesi, ookistlerin eksizyon oranını artırarak sporozoit verimini artırır.
- Ookist süspansiyonunu 37 ° C'de 1–1.5 saat inkübe edin.
- Eksitasyon derecesi için numuneyi mikroskobik olarak kontrol edin; sporozoitlerin iyi bir şekilde geri kazanılması için% 60-80 eksizyon mantıklıdır. Eksizyon seviyesi düşükse, daha uzun süre inkübe edin (30 dakika ila 1 saat daha).
- Başlangıç ookistlerinin sayısına göre eksizyon yüzdesini belirleyin. Eksistasyon şu şekilde hesaplanır:
% eksistasyon = [1 - (sağlam ookist sayısı/başlangıçtaki ookist sayısı)] x 100
- Sporozoitleri geri kazanmak için 20 dakika boyunca 3.400 x g'da santrifüjleme ile 14 mL PBS veya ortam ekleyerek, hücreleri (sağlam ookistler, ookist kabukları ve sporozoitler) karıştırarak ve geri kazanarak eksistat reaktiflerini çıkarmak için hücreleri yıkayın. Hücre kaybını önlemek için dikkatlice aspire edin.
- 3 x 107 ookist / mL elde etmek için sporozoit peletini 1-2 mL DMEM'de yeniden süspanse edin (başlangıç ookistlerinin sayısına bağlı olarak).
- Kalan ookistleri ve kabukları çıkarmak için, süspansiyonu 3 μm'lik bir filtreden süzün (Şekil 1B). 10 mL'lik bir şırınga haznesine bağlı polikarbonat filtre (3 μm gözenek boyutu) ile donatılmış 47 mm'lik bir filtre tutucu aparatı kullanın. Filtre tutucu aparatı 15 mL'lik bir tüpün üzerine yerleştirin. Düzeneği bir buz kovasına veya soğuk bir odaya yerleştirin.
- Filtre tertibatına 7,5 mL sporozoit süspansiyonu ekleyin ve yerçekimi ile süzülmesine izin verin. 7,5 mL başka bir DMEM.
ile yıkayın
not: Sporozoit izolasyonunda başarıyı sağlamak için taze ookistler ve iyi eksizyon kritik öneme sahiptir. Çok fazla eksizstlenmemiş ookist varsa, süspansiyon yerçekimi ile akmayacaktır. Şırıngaya baskı uygulamak, kistlenmemiş ookistleri zorlayabilir. Sporozoitlerin mikroenjeksiyonu, ookistlerinkinden daha zordur, çünkü sporozoitler kılcal damarları topaklayabilir ve tıkayabilir. Bunu önlemek için, organoidlere sporozoitler enjekte ederken daha geniş bir kılcal uç yapmanızı öneririz. Yeterli enfeksiyon seviyelerine ulaşmak için, ookistlerle enfekte olmuş organoidlere kıyasla her organoide 2-4 kat daha fazla sporozoit enjekte edilmesi gerekir.
- Filtrelenmiş sporozoit süspansiyonunu, sporozoitleri peletlemek için 20 dakika boyunca sallanan bir kova rotoru kullanarak 3.400 x g'de santrifüjleyin.
- %0,05 (a/h) Hızlı Yeşil boya ve L-glutatyon, betain, L-sistein, linoleik asit ve taurin içeren indirgeyici tampon ile desteklenmiş 50-100 μL OME veya OMD organoid kültür ortamında (Malzeme Tablosuna bakınız) yeniden süspanse edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
not: Ookistlerin çok uzun süre kuluçkaya yatırılması, sporozoitlerin parçalanmasına ve kötü iyileşmeye neden olabilir ve bu nedenle kaçınılmalıdır.
2. Mikroenjeksiyon için İnsan Bağırsağının İn Vitro Kültürü
- Genişleme ve farklılaşma ortamı koşulları altında kültür bağırsak organoidleri.
NOT: Bağırsak yayılımının ayrıntıları daha önce başka makalelerde açıklanmıştır (medya tarifleri için Malzeme Tablosuna bakınız). Burada, Cryptosporidium enjeksiyonu ve büyümesi için optimizasyona özel referansla organoid kültür yöntemini kısaca açıklıyoruz. Organoidlerdeki parazitlerin görüntülenmesi için, bir genişleme ortamında büyütülen organoidlerin, farklılaşma ortamında yetiştirilenlere göre tercih edildiğini, çünkü bir farklılaşma ortamında yetiştirilen organoidlerde görülenden daha az kalıntı birikimi olduğunu bulduk. Bununla birlikte, amaç ookistleri izole etmekse, farklılaşma ortamında yetiştirilen organoidler çok daha fazla sayıda ookist üretir.
- Hücre dışı matrikste 3D kültürlerde organoidleri koruyun (Malzeme Tablosuna bakınız) 37 ° C'de. Üstüne OME (organoid genişleme ortamı) ekleyin ve her gün yenileyin.
- Mikroenjeksiyon için organoidleri ayırmak ve plakalamak için, insan organoidlerini içeren 6 oyuklu plakadan ortamı çıkarın, kuyuya F12 +++ ekleyin (Malzeme Tablosuna Bakın) ve 1 mL pipet ucuyla birkaç kez pipetleyerek matrisi parçalayın. Hücreleri 15 mL'lik bir tüpe toplayın (daha sonraki prosedürler için tüp başına 2 mL F12 +++ yeterlidir).
- 15 mL'lik başka bir tüpe 10-12 mL F12+++ ekleyin ve ortama ateşle parlatılmış bir cam pipet yerleştirin, insan bağırsak organoidlerini parçalamak için 3 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
not: Uzun bir cam pipet (20-30 cm) kullanın ve kısa bir süre ateşle parlatın. Organoidler zarar görebileceğinden açıklığı (1 mm çapında) çok küçük yapmayın. Pipetin ucunu kısa bir süre ateşle parlatarak pürüzsüz hale getirin. Organoidleri ~ 50 μm'lik daha küçük parçalara ayırın.
- 5-7 mL'ye kadar F12+++ ekleyin ve 350 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
not: Bu adımdaki santrifüjleme hızı, hücre dışı matristen iyi ayrılmış iyi bir hücre peleti yapmak için normalden daha yüksektir (bkz. Malzeme Tablosu). Fare ince bağırsak organoidleri ile karşılaştırıldığında, insan ince bağırsak organoidlerinin parçalanmasının daha zor olduğunu gözlemledik.
- Hücreleri rahatsız etmeden mümkün olduğu kadar çok ortamı çıkarın, daha sonra peleti 4 ° C'de tutulan matris ile yeniden süspanse edin; Altı oyuklu bir plakanın oyuğu başına 200-300 μL matris gereklidir. Oldukça yüksek bir hücre yoğunluğunu korumak için organoidler üçte bir oranında bölünmelidir.
- Organoidleri, altı oyuklu bir plakanın kuyucuğunda her biri yaklaşık 5-10 μL'lik matris damlacıkları halinde kaplayın. 37 ° C'de 20-30 dakika inkübe edin ve ardından üstüne genleşme ortamı (OME) ekleyin.
- Ortamı her 2-3 günde bir değiştirin.
not: Yaklaşık 5-7 gün içinde, EM'de büyüyen organoidler 100-200 μm'lik bir boyuta ulaşır ve enjeksiyona hazırdır.
- Organoidleri ayırt etmek için, EM'de 5-6 gün sonra, ortamı farklılaşma ortamı (DM) koşullarına değiştirin ve parazitleri enjekte etmeden önce 5-6 gün daha tutun.
not: Organoidlerin genişlemesi için, organoidlerin yoğun bir şekilde kaplanması önerilir. Mikroenjeksiyon için, daha düşük bir yoğunlukta kaplanmış organoidler ile altı oyuklu bir plakanın kullanılması önerilir. Örneğin, altı oyuklu bir plakanın üç oyuğundan mikroenjeksiyonlar için tam altı oyuklu bir plakaya plaka organoidleri. Matris, uzun süreli depolama için -20 °C'de muhafaza edilmeli ve kullanımdan önce 4 °C'de veya buz üzerinde çözülmelidir.
3. Ookistlerin/Sporozoitlerin Organoid Lümene Mikroenjeksiyonu
- Parazitleri 3D organoidin apikal tarafına mikroenjekte edin (Şekil 2).
- Mikropipet çektirme kullanarak 1 mm çapında cam kılcal damarlar hazırlayın.
not: Mikropipet çekicide kullanılan ayarlar (Bkz. Malzeme Tablosu) Isı = 663, Çekme = 100, Hız = 200, Zaman = 40 ms'dir. Ayarların belirli bir makine için kullanıcı talimatlarına göre ayarlanması gerekecektir.
- Kılcal damarın ucunu forseps ile kesin. Kılcal ucun boyutu/çapı yaklaşık 9-12 μm'dir; Bu, ookistlerin kolay akışını sağlar (4-5 μm boyutunda).
- Mikro yükleyici uçlarını kullanarak kılcal damarları ookist veya sporozoit süspansiyonu ile doldurun.
- Okist dolu kılcal damarı bir mikro enjektöre yükleyin.
- Basıncı sabit tutarak, 5x büyütmede ters çevrilmiş bir mikroskop altında her bir organoide 100-200 nL süspansiyon mikroenjekte edin. Mikroenjeksiyondan sonra, ortamı her gün OME veya OMD (organoid farklılaşma ortamı) ile yenileyin ve plakayı 37 ° C'de tutun.
not: Mikroenjeksiyon için mikromanipülatör kullanmıyoruz. Her numunede eşit enjeksiyonu sağlamak için tüm deney için aynı kılcal damarın kullanılması önerilir.
