Mikroenjeksiyon yoluyla bağırsak organoidlerinde parazit enfeksiyonu geliştirme tekniği

Özet

Kaynak: Dutta, D., et al. Mikroenjeksiyon ile 3D Doku Kaynaklı İnsan Organoid Kültür Sistemlerinde Cryptosporidium Enfeksiyonunun İncelenmesi. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu videoda, insan bağırsağı organoid enfeksiyonu modeli geliştirmek için bir mikroenjeksiyon tekniği gösterilmektedir. Parazit Cryptosporidium parvum'un enfeksiyöz sporozoit aşaması organoid lümene mikroenjekte edilir. Organoidin epitel hücrelerini istila ettikten sonra, yaşam döngüsünü tamamlamak için eşeysiz ve eşeyli üreme geçirir ve enfeksiyonu yayar.

Protokol

1. C. parvum Ookistlerinden Sporozoitlerin İn Vitro Saflaştırılması

1. Yukarıda tarif edildiği gibi ağartıcıyı ağarttıktan ve yıkadıktan sonra sporozoitleri C. parvum ookistlerinden arındırın.
   1. Ookistleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın. 1 x 10⁷ ookist / mL elde etmek için ookistleri oda sıcaklığında eksitasyon ortamında (DMEM'de% 0.75 w / v sodyum taurokolat) yeniden askıya alın. Taurokolat ilavesi, ookistlerin eksizyon oranını artırarak sporozoit verimini artırır.
   2. Ookist süspansiyonunu 37 ° C'de 1–1.5 saat inkübe edin.
   3. Eksitasyon derecesi için numuneyi mikroskobik ola....

Sonuçlar

Şekil 1: Cryptosporidium ookistlerinin ve sporozoitlerinin hazırlanması ve saflaştırılması. (A) Enfeksiyon için ookist ve sporozoit hazırlığı için kullanılan yöntemin şematik gösterimi. (B) Ookistlerin in vitro eksiksiyonunu gösteren görüntü. Eksiztlenmemiş ookistlerin ve kabukların filtrasyonu, saflaştırılmış bir sporozoit çözeltisi verir. Ölçek çubuğu = 10 .......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Bazal membran ekstresi (hücre dışı matris)	AMSBIO (İngilizce	3533-010-02
Dynamag 15 raf	Thermofisher Bilimsel	12301D
Dynamag 2 raf	Thermofisher Bilimsel	12321D
EMD Millipore İzopor Polikarbonat Membran Filtreleri- 3μm	EMD-Kırlangıç	TSTP02500
Hızlı yeşil boya	Sigma	F7252-5G
Femtojet 4i Mikro Enjektör	Eppendorf Belediyesi	5252000013
1 mm çapında cam kılcal damarlar	TEFE	TW100F-4
Matrigel (hücre dışı matris)	Corning	356237
Mikrofuj tüpü 1.5ml	Eppendorf Belediyesi	T9661-1000EA
Mikro yükleyici uçları	Eppendorf Belediyesi	612-7933
Mikropipet çektirme P-97	Deklanşör enstrümanı	P-97
Penstrep Belediyesi	Gibco (Gibco)	15140-122
Sodyum hipoklorit (% 5 kullanın)	Clorox Gölü	50371478
Süper çubuk slaytlar	Su Doğan, Inc	S100-3 Serisi
Swinnex-25 47mm Polikarbonat filtre tutucu	EMD-Kırlangıç	SX0002500
Taurokolik asit sodyum tuzu hidrat	Sigma	T4009-5G
Ara-20	Merck	8221840500
Girdap Cin 2	Bilimsel endüstriler, Inc	SI0236
Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes)			Nihai miktar
DMEM (Ömer Çiçeğ	Canlandırıcı	12634-010	500 ml
Penstrep Belediyesi	Gibco (Gibco)	15140-122	500ml DMEM'de 5ml stok
Glutamax (Glutamaks)	Gibco (Gibco)	35050038	500ml DMEM'de 5ml stok
Hepes Belediyesi	Gibco (Gibco)	15630056	500ml DMEM'de 5ml stok
INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Genişleme mediası)			Son konsantrasyon
A83-01	Tocris (Türkçe)	2939-50mg	0,5μM
Reklam+++			100 ml'ye kadar hazırlayın
B27	Canlandırıcı	17504044	1 katı
EGF (Türkçe)	Peprotech teknolojisi	AF-100-15	50 ng/mL
Gastrin (Gastrin)	Tocris (Türkçe)	3006-1 mg	10 nM
NAC (Kuzey Amerika Cumhuriyeti)	Sigma	A9125-25G	1,25 milyon
Nıc	Sigma	N0636-100G	10 milyon
Noggin CM	Kurum içi*		%10
P38 inhibitörü (SB202190)	Sigma	S7076-25 mg	10μM
PGE2 (İngilizce	Tocris (Türkçe)	2296-10	10 nM
Çuha çiçeği	İnvivoGen	KARINCA PM-1	1ml/500ml ortam
RSpoI CM	Kurum içi*		%20
Wnt3a CM	Kurum içi*		%50
Kurum içi* - hücre hatları talep üzerine sağlanacaktır
BAĞIRSAK ORGANOID MEDIA-OMD (Farklılaşma ortamı)			Organoidleri ayırt etmek için, genişleyen ince bağırsak organoidleri, ayrıldıktan sonra altı ila yedi gün boyunca Wnt açısından zengin bir ortamda büyütüldü ve daha sonra bir farklılaşma ortamında büyütüldü (Wnt, nikotinamid, SB202190'nin bir farklılaşma ortamında çekilmesi (Wnt, nikotinamid, SB202190, prostaglandin E2'nin Wnt açısından zengin bir ortamdan çekilmesi veya EOM)
İndirgeyici tampon (enjeksiyon için ookistlerin ve sporozoitlerin yeniden süspansiyonu için)			Son konsantrasyon
L-Glutatyon azaltılmış	Sigma	G4251-10MG	0,5 μg/μl OME/OMD/LOM
Betain	Sigma	61962	0,5 μg/μl OME/OMD/LOM
L-Sistein	Sigma	168149-2.5G	0,5 μg/μl OME/OMD/LOM
Linoleik asit	Sigma	L1376-10MG	6.8 μg/ml OME/OMD /LOM
Taurin	Sigma	T0625-10MG	0,5 μg/μl OME/OMD/LOM

) Serisi Serisi Uçağı Serisi Serisi Sertifikası Serisi ) Serisi