Konakçı sivrisinek türevli sporozoitler kullanılarak deneysel serebral sıtmanın bir fare modelinin oluşturulması

Özet

Kaynak: Hoffmann, A. ve ark., Manyetik Rezonans Görüntüleme Kullanılarak Deneysel Serebral Sıtma Modelinde Ödem Gelişimi ve Mikrovasküler Patolojinin İn Vivo İzlenmesi.J. Vis. Uzm.(2017)

Bu video, serebral sıtmanın deneysel bir fare modelinin oluşturulmasını göstermektedir. Plasmodium berghei ile enfekte dişi sivrisineklerden izole edilen sporozoitler, kısıtlanmış bir farenin kuyruk damarlarına enjekte edilir, bu da kan-beyin bariyerinin bozulmasına ve beyin iltihabına yol açarak serebral sıtmaya neden olur. Bu enfekte fare modeli, serebral sıtma ile ilişkili in vivo mikrovasküler patolojiyi incelemek için değerli bir araç sunar.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Enfeksiyon

1. Anopheles stephensi sivrisineklerini Plasmodium berghei ANKA ile gametositemik bir farede 15 dakika besleyerek enfekte edin. Enfekte sivrisinekleri %80 nemde ve 21 °C'de tutun.
2. Kan yemeğinden 17 ila 22 gün sonra dişi sivrisinekleri kafeslerinden toplayın. Onları uyuşturmak için buzun üzerine koyun.
3. Forseps kullanarak, bir damla soğuk RPMI ortamı ile kaplı bir cam slayt üzerine üç ila dört sivrisinek yerleştirin. Slaytı mikroskop altına yerleştirin.
4. Forseps kullanarak, sivrisinekleri baş ve vücut arasında dikkatlice gerin. Tükürük bezini bir şırınga ve iğne kullanarak izole edin. Bu işlemi kalan sivrisineklerle tekrarlayın.
5. Tükürük bezlerini bir cam pipetle emerek ve 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayarak cam slayttan toplayın.
   not: Enfeksiyon oranlarına bağlı olarak, genellikle tükürük bezi başına 8.000 ila 15.000 enfeksiyöz sporozoit elde edilebilir.
6. Yaklaşık 3 dakika boyunca, sporozoitleri tükürük bezi dokusundan izole etmek için santrifüj tüpü içindeki izole edilmiş tükürük bezlerini küçük, plastik bir çubukla parçalayın.
7. Sporozoitleri kalan dokudan arındırmak için 1.000 x g ve 4 ° C'de 3 dakika santrifüjleyin.
8. Sporozoitleri (SPZ) içeren süpernatanı yeni bir santrifüj tüpüne pipetleyin ve saflaştırılmış sporozoitleri bir Neubauer hemositometresinde sayın.
9. Fosfat tamponlu salin ekleyerek saflaştırılmış sporozoitlerin konsantrasyonunu 10.000 / mL'ye ayarlayın.
10. Enfeksiyonu başlatmak için akraba içi C57BL / 6 farelerinin kuyruk damarlarına toplam 1.000 sporozoit (0.1 mL) enjekte edin. Enjeksiyonları kolaylaştırmak için, C57BL/6 fareleri bir tutucuya yerleştirin ve kuyruk damarlarının görüntülenmesine yardımcı olmak için kuyrukları ılık (yaklaşık 37 °C) suya koyun.
    not: Enjeksiyonun kendisi birkaç saniye içinde gerçekleştirilebilen kısa bir prosedürdür.
11. Günde bir kez, SPZ enfeksiyonundan sonraki 3. günden itibaren kan yaymalarında kan evresi parazitemisini kontrol edin.
12. Sporozoit enjeksiyonundan sonraki 5. günden itibaren fareleri günde bir kez Hızlı Murin Koma ve Davranış Ölçeği (RMCBS) skoru ile değerlendirin.
13. Fareleri manyetik rezonans görüntüleme (MRI) görüntüleme ile Hızlı Murin Koma ve Davranış Ölçeği (RMCBS) skoruna ve ele alınacak araştırma sorusuna göre değerlendirin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
İzofluran	Baxter	1001747	anestezi için
Dotarem Belediyesi	Guebert ·	1086923	Gd-DTPA kontrast madde; 0.5mmol / ml
Amira (Görüntü İşleme Programı)	FEI Grubu		Sürüm Amira 5.3.2
MATLAB (MATEMAT)	MathWorks, Inc.,		Sürüm 2012b
FDT araç kutusu	FMRIB'in Yazılım Kütüphanesi