$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Bronkoalveoler Lavaj (BAL) Makrofajları
- (1) insan deneklerde bronkoskopi ile ve (2) farelerde intratrakeal aspirasyon kullanarak akciğer makrofajları elde etmek için BAL kullanın.
not: Makrofajların edinimi genellikle bu hücrelerin bir miktar aktivasyonuna neden olur. Makrofajlar, potansiyel bir tıbbi sorunu araştırmak için bronkoskopi gerektiren hastalardan elde edilir ve tüm denekler makrofaj hücre dışı tuzakların veya MET'lerin analizi için uygun olmayabilir (bunun her bir proje için belirlenmesi gerekecektir).
- BAL çözeltisini alın ve bir pelet oluşturmak için döndürün (10 dakika boyunca 500 x g), oda sıcaklığında kültür ortamı (Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI)% 5 fetal buzağı serumu ve% 1 L-glutamin ile) ile iki kez yıkayın ve ardından hücreleri 4 mL kültür ortamında seyreltin.
- Gerekirse, resmi bir diferansiyel sayım isteyin; hücrelerin çoğu (genellikle% >80) makrofaj olacaktır.
not: Bu genellikle farklı hücre tiplerinin morfolojik görünümünü kullanan bir klinik histoloji servisi tarafından gerçekleştirilecektir.
- Tripan mavisi dışlaması ve bir hemositometre kullanarak BAL çözeltisinde canlı bir makrofaj hücresi sayımı gerçekleştirin.
not: BAL çözeltisi, adım 1.1'de belirtildiği gibi insanlardan ve farelerden elde edilir.
- Oyuk başına 500 μL kültür ortamında lameller üzerindeki 24 oyuklu plakalara 1 - 4 x 105 makrofaj ekleyin ve gece boyunca 37 ° C'de bırakın; hücreler lamellere yapışacaktır. İnsan örnekleri için, bakteriyel kontaminasyonu önlemek için antibiyotikler (ör. penisilin ve streptomisin, 104 U / mL) ekleyin.
2. BAL Makrofajlarının İmmünofloresan Etiketleme/Mikroskobu
NOT: Hücreler yukarıda belirtildiği gibi lamellere yapıştırılır.
- Kültür ortamını çıkarın ve hücreleri bir kez fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. Hücreleri 10 dakika boyunca% 2 paraformaldehit/periodat/lizin (PLP) fiksatifinde sabitleyin.
- Hücreleri PBS'de kısa bir süre yıkayın ve ardından 20 dakika boyunca PBS'de% 0.2 Tween 20'de geçirgenleştirin.
- PBS'de 30 dakika seyreltilmiş% 5 sığır serum albümini (BSA) içinde% 10 tavuk serumu ile hücreleri bloke edin.
- 37 ° C'de 1: 100 konsantrasyonlarda (daha spesifik ayrıntılar Malzeme Tablosunda listelenmiştir) oda sıcaklığında 1 saat boyunca birincil ve izotip kontrol antikorları ile inkübe edin.
not: BAL örnekleri için, spesifik bir makrofaj belirteci genellikle gerekli değildir.
- Birincil antikorların eklenmesinden sonra, hücreleri PBS'de yıkayın ve oda sıcaklığında 40 dakika boyunca karşılık gelen ikincil antikorlarla daha fazla inkübe edin.
- Bölümleri PBS'de yıkayın ve 405, 488, 561 ve 647 nm lazer uyarımlarında ve 40X, 1.0 NA yağ hedefinde konfokal bir mikroskop (yukarıda belirtildiği gibi) kullanarak görselleştirme için DAPI tabanlı bir montaj ortamı ile monte edin.