1. Raportör Proteini Kodlayan Rekombinant HBV Üretimi
- HepG2 hücrelerinin hazırlanması
- % 10 fetal sığır serumu (FBS), 100 U / ml penisilin, 100 μg / ml streptomisin ve 100 U / ml esansiyel olmayan amino asitler ile desteklenmiş hücre kültürü ortamını (Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı veya DMEM) hazırlayın.
- Plaka: 4 x 10,6 HepG2 hücresi, transfeksiyondan bir gün önce 10 ml kültür ortamında 10 cm'lik kollajen kaplı bir kapta. HepG2 hücrelerini nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.
not: Yaklaşık 4 x 106 HepG2 hücresi, 10 ml kültür ortamında 10 cm'lik kollajen kaplı bir kapta kaplandığında, ertesi gün% 70-90 oranında birleşmiş olacaktır.
- Transfeksiyon
- HepG2 hücrelerini, üreticinin talimatlarına göre bir transfeksiyon reaktifi kullanarak 5 μg pUC1.2HBV (hepatit B virüsü) delta epsilon ve 5 μg pUC1.2HBV/NL15 ile transfekte edin.
- Ertesi gün, kültür ortamını çıkarın ve 10 ml taze kültür ortamı ekleyin.
- Transfeksiyondan bir hafta sonra, rekombinant HBV'yi içeren kültür ortamını 50 ml'lik bir tüpe aktarın ve adım 1.3.1'e geçin. Transfekte edilmiş hücreleri içeren plakaya 10 ml taze kültür ortamı ekleyin.
not: Rekombinant HBV'nin üretimi 4 hafta boyunca sürdürülür. Rekombinant HBV içeren kültür ortamı 4 °C'de 1 ay süreyle saklanabilir.
- Rekombinant HBV'nin saflaştırılması
- Santrifüjleme ile rekombinant HBV içeren kültür ortamından hücre kalıntılarını çıkarın (5 dakika boyunca 2.300 x g).
- Süpernatanı 0,45 μm'lik bir membran filtreden geçirin.
- Eşit hacimde %26 PEG/1.5 M NaCl (polietilen glikol 6000: 130 g, NaCl, 49 g, 1 ml 0.5 M EDTA (etilendiamintetraasetik asit) pH 8.0 ve 5 ml 1 M HEPES (4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit) (pH 7.6 in 500 ml) rekombinant HBV içeren kültür ortamına ekleyin ve hafifçe karıştırın. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
- 4 ° C'de 20 dakika boyunca 2.300 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve peleti 0.5 ml TNE (10 mM Tris (tris (hidroksimetil) aminometan), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) içinde çözün.
- Kalıntıları 5 dakika boyunca 2.300 x g'da santrifüjleme ile çıkarın.
- TNE'de 0.8 ml %20 sükroz üzerine rekombinant HBV içeren 0.5 ml TNE yükleyin.
- 100.000 × g'da 15 °C'de 3 saat santrifüjleyin.
- Süpernatanı mümkün olduğunca atın, ve peleti kurtarın. 40 ml başlangıç kültür ortamı başına 1 ml serumsuz DMEM içinde tekrar süspanse edin.
- Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
- 0,45 μm'lik bir filtreden süzün. 0,5 ml alikot hazırlayın ve -80 °C.
'de saklayın
not: Orijinal virüs örneğinin raportör protein kontaminasyonu gözlenirse, virüsü 2 saat boyunca 100.000 x g'da TNE'de% 5-30 sükrozun yoğunluk gradyanı ultra santrifüjlemesi veya 50 saat boyunca 150.000 x g'de 1.1-1.6 g / ml'den CsCl yoğunluk dengeli santrifüjleme ile saflaştırın.
2. Rekombinant HBV Enfeksiyonu
- Kültür HepG2 hücreleri, nemlendirilmiş %5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de %10 FBS, 100 U/ml penisilin, 100 μg/ml streptomisin, 250 μg/ml G-418 (genetik) ve 100 U/ml esansiyel olmayan amino asitlerle desteklenmiş DMEM'de HBV enfeksiyonuna duyarlı NTCP (sodyum taurokolat ko-taşıyıcı polipeptit) (HepG2/NTCP) eksprese eder
.
- Enfeksiyondan bir gün önce, yaklaşık 5 x 104 HepG2 / NTCP hücresini 0.1 ml kültür ortamında 96 oyuklu kollajen kaplı bir plakaya yerleştirin.
- Rekombinant HBV'yi 37 ° C'lik bir su banyosunda, şişede küçük bir buz kalıntısı kalana kadar çözdürün.
- Aşağıdakileri birleştirerek ortamı enfeksiyon için hazırlayın: 1x fosfat tamponlu salin (PBS), 2 μl dimetil sülfoksit (DMSO), 10 μl rekombinant HBV ve 78 μl taze kültür ortamında 10 μl% 40 PEG8000 96 oyuklu bir plakanın oyuğu başına.
- 96 oyuklu plakanın bir oyuğuna 100 μl rekombinant HBV çözeltisi ekleyin.
- Enfeksiyondan bir gün sonra, enfekte olmuş hücreleri virüs fraksiyonundan kirletici raportör proteini çıkarmak için oyuk başına 300 μl PBS ile 3 kez yıkayın.
- Enfekte olmuş hücreleri bir hafta veya daha kısa süreyle% 2 DMSO içeren 200 μl kültür ortamında inkübe edin.
3. Analiz
- Enfeksiyondan bir hafta sonra, enfekte olmuş hücreleri PBS ile 3 kez yıkayın.
- Enfekte olmuş hücrelere 50 μl lizis tamponu ekleyin.
- Kültür plakasını 5 dakika sallayın ve ardından 5 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüjleyin.
- Luminometre plakasına 50 μl raportör alt tabakası ekleyin.
- Raportör substratı içeren bir luminometre plakasına 20 μl hücre lizatı ekleyin. Kısa bir süre girdap yaparak karıştırın.
- Plakayı luminometreye yerleştirin ve okumayı başlatın.
