Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir
.
1. Gerekli Çözümler
- Zebra balıklarının tutulduğu akvaryumdan su ile 150 mg / L (anestezi için) veya 300 mg / L (ötenazi için) etil 3-aminobenzoat metansülfonat (MS-222) çözeltisi hazırlayın. Küçük bir tankı 1 L anestezik solüsyonla doldurun ve havalandırın.
- Balıkların geri kazanılması için başka bir küçük tankı MS-222 içermeyen 1 L akvaryum suyuyla doldurun ve havalandırın.
- 10x steril stok solüsyonundan 50 mL 1x PBS yapın.
- Sitometri analizi / bağırsak hücresi izolasyonu için,% 1 v / v penisilin ve streptomisin ile Dulbecco'nun modifiye kartal ortamında (DMEM) bir stok çözeltisinden veya tozdan balık başına 1 mL için yeterli taze% 0.15 kollajenaz Tip IV çözeltisi hazırlayın (malzemelere bakınız). 2 mL'lik santrifüj tüplerinde 1 mL'lik alikotlar (balık başına 1 adet) yapın. Diseksiyon adımından 30 dakika öncesine kadar 4 °C'de tutun.
- Konfokal mikroskopi/numune fiksasyonu için, PBS'de 50 mL taze %4 paraformaldehit (PFA) çözeltisi hazırlayın veya çeker ocakta -20 °C'lik bir dondurucudan bir stok çözeltisini çözün.
Dikkat: PFA toksiktir. Lütfen onunla çalışmadan önce malzeme güvenlik bilgi formunu okuyun. Eldivenler ve koruyucu gözlükler giyilmeli ve solüsyonları her zaman çeker ocak içinde bırakmalıdır.
2. Ekipmanın Oral Entübasyon için Hazırlanması
- İğne ucunu kapatmak için 31 G Luer kilit iğnesine yaklaşık 1 cm ince bir silikon tüp yerleştirin.
- 10 μL'lik bir steril filtre pipet ucunu (yaklaşık 2 cm) kesin, ince ucunu alın ve bir kılıf olarak silikon tüpün üzerine yerleştirin. Hayvana zarar vermemek için pipetin iğnenin ucunun ötesine uzandığından emin olun.
- İğneyi 100 μL Luer kilitli şırıngaya takın.
not: Tedaviler arasında daima etanol ve ardından fosfat tamponlu tuzlu su (PBS, bkz. Malzemeler) ile durulayın.
3. Floresan Nanopartikül Süspansiyonunun Hazırlanması
- Protein nanopartikülünü Atto-488 NHS esteri (Malzeme Tablosuna bakınız) veya üreticinin talimatlarına göre uygun bir floresan boya ile etiketleyin.
- Nanopartikülleri 2 mg / mL konsantrasyonda 0.1 M sodyum bikarbonat tamponunda yeniden süspanse edin.
- Atto 488 NHS esterini amin içermeyen dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 2 mg / mL'de çözün. Etiketleme verimliliğini kontrol etmek için 10 μL'lik bir alikot tutun.
- Nanopartikülleri ve Atto 488 NHS esterini karanlıkta karıştırarak molar oranda 1: 2 (protein: boya) karıştırın.
- Etiketli nanopartikülleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 8.000 x g'da santrifüjleme ile döndürün, süpernatanı çıkarın ve etiketleme verimliliğini kontrol etmek için saklayın.
- Etiketli nanopartikülleri, 1 mL 0.1 M sodyum bikarbonat tamponunda girdap ve yukarı ve aşağı pipetleme ile yeniden süspanse ederek yıkayın. Daha sonra süpernatanı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 8.000 x g'da santrifüjleme ile atın. Adım 3.6'yı 5 kez tekrarlayın.
- Peleti 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde 5 mL 0.1 M sodyum bikarbonat tamponunda yeniden süspanse edin ve 1.5 mL'lik santrifüj tüplerinde (30 alikot) floresan nanopartikülün alikotlarını yapın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 8.000 x g'da döndürün, süpernatanı atın ve -80 ° C'de ışıktan koruyarak saklayın.
4. Zebra Balığı Anestezisi ve Oral Entübasyon
- Bağırsakları boşaltmak için deneyden en az 48 saat önce balığı (>0,5 g) oruç tutun.
- İklimlendirmeye izin vermek için balıkları (12 balık) deneyden bir gece önce deney tanklarına (6 L) taşıyın12.
- Nanopartikül çözeltisini iyice girdaplayın (örneğin, 2.500 rpm ve 30 s) ve istenen hacimde nanoparçacık süspansiyonu (örneğin, 20-50 μL) korunan iğneye bağlı şırıngaya çekin.
- Balıkları havalandırılmış 150 mg/L MS-222 çözeltisine (bkz. bölüm 1) tankın dibine batana ve kuyruk yüzgeci sıkışmasına tepki vermeyene kadar yerleştirin; bu işlem 5 dakikadan az sürer.
- Anestezi uygulanmış balığı bir ağ ile hızlı bir şekilde ıslak plastik bir tepsiye aktarın, hayvanı iğneye bakacak şekilde yatay olarak yönlendirin ve hemen oral entübasyona başlayın.
- Balığı bir elinizle dikkatlice destekleyin ve diğer elinizle korunan iğneyi kullanarak ağzını açın. İğneyi yemek borusundan ağız açıklığından yaklaşık 1 cm uzağa kadar nazikçe batırın.
not: Operatör, pipet ucunun ucu solungaçtan geçtiğinde hafif bir direnç hissedebilir. Solungaç delinmesine neden olabilecek iğne girişini çok fazla açılandırmamaya dikkat edin.
- Nanopartikül süspansiyonunu yavaşça balığa enjekte edin. Süspansiyonun solungaçlardan veya ağızdan dışarı doğru akmadığından emin olun.
- İğneyi nazikçe çıkarın ve balığı geri kazanım tankına yerleştirin (bkz. bölüm 1). İyileşme genellikle 1 dakika sürer.
- Balıkta herhangi bir anormallik olup olmadığını dikkatlice kontrol edin (örneğin, solungaçlarda kanama bir perforasyon belirtisidir).
- Balıklar iyileştikten sonra onları deney tanklarına geri koyun.
