$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Hayvanları Uyuşturun, Entübe Edin ve Aşılayın
NOT: 100 - 120 g ağırlığında spesifik patojen içermeyen (SPF) bağışıklığı yeterli erkek Sprague-Dawley sıçanları önerilir. Tüm hayvanlara ad libitum yiyecek ve su sağlayın ve onları standart 12 saatlik aydınlık-karanlık döngüleri ile talaş veya diğer emici yataklarda sosyal olarak barındırın.
- Herhangi bir deney yapmadan önce, hayvan türü için uygun boyutta bir metal kanül ve polietilen boru alın ve sterilize edin. Steril 1 mL tek kullanımlık şırıngalar ve steril tek kullanımlık 25 gauge iğneler edinin.
Dikkat: Bu şırıngaları ve iğneleri her zaman keskin bir kaba atın.
- Sıçanlar için, yaklaşık 12 cm uzunluğunda, 0.9 - 1.0 mm iç çapa ve 1.0 - 1.2 mm dış çapa sahip ve bir ucunda yaklaşık 45 ° açıyla bükülmüş metal bir kanül satın alın veya üretin. İç çapı 0,4 mm ve OD 0,8 mm olan 11 ila 12 inç uzunluğunda polietilen boru kesin. (Bkz. Şekil 1A.)
- Metal kanülü bir cam, vidalı kapaklı tüpe yerleştirin ve sterilize etmek için standart yöntemlerle otoklava yerleştirin. Polietilen borunun kesilmiş uzunluklarını alkol içeren kapalı bir beherde ıslatın ve saklayın.
- Çalışma yüzeyini ve entübasyon cihazını hazırlayın.
- Çalışma yüzeyine, su banyosuna yakın temiz tek kullanımlık bir paspas yerleştirin. Metal kanülü cam saklama tüpü içinde bu yüzeye aktarın. Kapağı saklama tüpünden çıkarın ve kanülün "tutamak" ucunu tüpün açık ucuna kaydırın.
- Steril forseps kullanarak, beherden bir uzunlukta polietilen boruyu çıkarın ve steril metal kanülün içinden geçirin ve serbestçe hareket ettiğinden emin olun. Steril tek kullanımlık 25 gauge bir iğneyi (sıçanlar için) polietilen borunun serbest ucuna, iğneyi borunun içine birkaç mm kaydırarak yerleştirin. (Sıçan için Şekil 1A'ya bakın).
- Tek bir ötenazi hayvanında aşağıda açıklanan entübasyon prosedürünü izleyerek hayvana yerleştirme derinliğini belirtmek için hem metal kanül hem de polietilen boru üzerine kılavuz işaretleri yerleştirin. Gözlem için göğüs boşluğunu açın, ardından metal kanülü düzgün bir şekilde yerleştirin ve polietilen boruyu uygun şekilde ilerletin. Silinmez bir kalem kullanarak, kalan hayvanlara düzgün bir şekilde yerleştirilmesine yardımcı olmak için metal kanülü hayvanın ağzıyla birleştiği yeri ve metal kanülün üst kısmıyla birleştiği yerdeki polietilen boruyu işaretleyin.
- Bir çeker ocak içinde (veya uygun bir süpürme sistemi kullanarak), öğürme refleksi inhibe edilene kadar (yaklaşık 1 dakika) 1,5 L/dk oksijende %≤5 izofluran ile sağlanan kapalı bir odada bir seferde 6 hayvana kadar anestezi uygulayın.
not: Herhangi bir deney yapmadan önce, yanlışlıkla ölümcül maruziyeti önlemek için kullanılan özel koşullar altında (örn. odanın boyutu / türü ve hayvan boyutu / türü / türü) izofluran için güvenli dozu ve maruz kalma süresini belirleyin.
- Steril tek kullanımlık 1 mL'lik bir şırıngayı (sıçanlar için) steril salin ile steril ucu salinin içine yerleştirerek ve pistona geri çekerek doldurun. Şırıngayı polietilen boruya takılan iğneye takın ve şırınga boşalana kadar tüm tuzlu su hacmini borudan yıkayın.
- Şırıngayı, su banyosundaki kaptan agar bazlı inokülum ile doldurun ve boru astarlanana kadar (örneğin tamamen agar ile doldurulan) agar'ı borudan yıkayın.
- Sıçanlar için, 25 gauge iğneyi (polietilen boruya takılı) tek kullanımlık şırıngadan çıkarın. Kullanılmış şırıngayı keskin bir kaba atın. Yeni, steril tek kullanımlık 1 mL'lik bir şırıngayı, steril ucu aşının içine yerleştirerek ve pistonu geri çekerek su banyosundaki kaptan agar bazlı aşı ile doldurun. İğneyi (polietilen boruya takılı) yeniden takın ve boru tamamen agar ile dolana kadar pistona bastırarak agarı borudan yıkayın.
- Anestezi odasından bir hayvanı çıkarın. Hayvanı, Şekil 1C'de gösterildiği gibi başı sağda ve kuyruğu sola bakacak şekilde tek kullanımlık mat üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
- Entübasyon cihazını (yani polietilen boru ile donatılmış metal kanül) kullanarak, hayvanı entübe edin ve kanülü sol akciğerin büyük lobuna yerleştirin (bkz. Şekil 1D).
- Metal kanülün serbest ucunu hayvanın ağzına sokun. Kanülü, serbest ucu yukarı doğru açılı olacak şekilde çevirin ve hafif bir bükülme hareketi ile gırtlak yapılarını dikkatlice atlayarak yavaşça trakeaya doğru ilerletin. Şekil 1C'de gösterildiği gibi trakeal halkaları sol işaret parmağıyla palpe ederken kanülü birkaç kez hafifçe ileri ve geri kaydırarak yemek borusunun aksine trakeaya yerleştirmeyi onaylayın.
- Kanül, trakeanın sol ve sağ bronşlara ayrıldığı çatallanmaya ulaştığında, kanülün sol bronşlara yerleştirildiğinden emin olmak için hayvanın sol tarafına doğru hafif bir bükülme hareketi yapın. Uygun derinliğe ulaşıldığını doğrulamak için önceden yerleştirilmiş kılavuz işaretini kullanarak, metal kanülü sol akciğerin yarısı ila dörtte üçü arasında olana kadar ilerletin.
- Metal kanül yerindeyken, polietilen boruyu birkaç mm ilerletin. Metal kanülün ucundan çıkacak ve akciğeri delmeyecek kadar ilerletildiğinden emin olmak için boru üzerine önceden yerleştirilmiş kılavuz işaretini kullanın.
- Her iki kanül de yerindeyken, agar süspansiyonunun 100 μL'sini (sıçanlar için) sol akciğerin büyük lobunun derinliklerine aşılamak için ekli şırıngayı kullanın (bkz. Şekil 1D). Polietilen borunun birkaç mm'sini geri çekin ve ardından sağlam entübasyon cihazını yavaşça çıkarın. Tekrar cam saklama tüpüne koyun ve iyileşmesi için hayvanı yeni bir kafese koyun.
