Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Gözyaşı bezi ekstraktının hazırlanması
>NOT: Sıçanlar, intraperitoneal ketamin (75 mg/kg) ve ksilazin (10 mg/kg) enjeksiyonu ile uyuşturuldu. Uygun anestezikizasyon, ayak parmağı kıstırma ve kuyruk kıstırma ile doğrulandı. Her işlemden sonra kuruluğu önlemek için farenin gözlerine oftalmik jel uygulandı. Anestezi uygulanan sıçanlar, hayvanları tamamen iyileşene kadar sıcak tutmak için uzak kızılötesi ışıkların altına yerleştirildi. Prosedürler ve iyileşme süresi boyunca, hayvanlar araştırmacılar tarafından yakından izlendi. Tüm malzemeler ve ameliyat aletleri kullanılmadan önce sterildi. Deneyin sonunda, sıçanlara intraperitoneal pentobarbital (80 mg / kg) enjeksiyonu ile ötenazi yapıldı. Tam ötenazi, kardiyak nabız eksikliği ve göz küresine dokunarak göz kırpma refleksi olmaması ile doğrulandı. Sıçanlar standart koşullarda barındırıldı: oda sıcaklığı, 21-23 °C; bağıl nem,% 30-70; aydınlık-karanlık döngüsü, dönüşümlü olarak 12 saat (sabah 7 - akşam 7).
- Ötenazi uygulanmış dişi Sprague-Dawley sıçanlarını (yaş aralığı 8 haftadan 16 haftaya kadar), bir kulağı masaya ve diğeri yukarı bakacak şekilde düz bir şekilde yerleştirin. Bir yaylı makasla açıkta kalan kulağın altında üst-alt 10 mm'lik bir kesi yapın. Lakrimal bezi çevredeki bağ dokusundan ve drenaj kanalından diseke ederek çıkarın.
- Bezleri gerekene kadar -80 °C'de saklayın. Bezleri buz üzerinde çözdürün. Makasla buz üzerinde mümkün olduğunca ince kıyın. Lakrimal bez başına 150 μL fosfat tamponlu salin veya 1x proteaz inhibitörü içeren PBS ekleyin.
- Numuneleri buz üzerinde 5 dakika boyunca 20 kHz'de sonikatör 10 s açık ve %10 genlikte 30 s kapalı olarak ayarlayın. Sonikasyonlu örnekleri 13.000 x g ve 4 ° C'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin.
- Süpernatanı pipetleyin ve yeni bir tüpe aktarın. Süpernatanı 1,5 mL'lik tüplere ayırın ve -80 °C'de saklayın. Protein konsantrasyonunu, üreticinin talimatlarına göre bir bikinkoninik asit tahlili ile ölçün.
2. Emülsiyon ve boğmaca toksininin hazırlanması
- Emülsiyon
- 1 mg / mL Mycobacterium tuberculosis H37Ra içeren 10 mL tam Freund adjuvanına 40 mg ısıyla öldürülmüş Mycobacterium tuberculosis H37Ra ekleyin ve iyice karıştırın.
not: Son tam Freund adjuvanı 5 mg / mL Mycobacterium tuberculosis H37Ra içerir.
- Ovalbümini tartın, PBS'de çözün ve 2 mg / mL ovalbümin ve 10 mg / mL lakrimal bez özü içeren bir antijen karışımı hazırlayın. Her hayvan için 200 μL'lik bir enjeksiyon hacmi hedefleyerek, hayvan sayılarına göre bir ana karışım hazırlayın.
- Eksik Freund adjuvanını veya tam Freund adjuvanını 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve antijen karışımına adjuvan hacminin 1: 1 oranında olduğundan emin olun. Antijen karışımını en yüksek hızda girdap yaparken adjuvana damla damla ekleyin, böylece dökülmeye neden olmaz. Tüm antijen eklendikten sonra 5 dakika boyunca girdaplamaya devam edin.
- Emülsiyonu 5 mL'lik bir şırıngaya aktarın ve bir şırınga konektörü aracılığıyla başka bir 5 mL'lik şırınga ile bağlayın. Karıştırmak için emülsiyonu bir şırıngadan diğerine itin.
not: Suya yerleştirildiğinde tek bir damlacık küre olarak kalırsa emülsiyon hazırdır. Sadece taze hazırlanmış emülsiyon veya gece boyunca 4 °C'de saklanan emülsiyon kullanılmalıdır.
- Boğmaca toksini
- 100 ng / μL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için 500 μL su içinde 50 μg boğmaca toksinini yeniden sulandırın. Toksinin tamamen çözüldüğünden emin olmak için kabı 30 saniye boyunca oylayın.
not: Filtrasyon yoluyla sterilize etmeyin, çünkü bu malzeme kaybına neden olur. Dondurmayın. Bu çözelti 4 °C'de en az 6 ay boyunca aktif kalır.
- PBS kullanarak 100 ng / μL boğmaca toksinini 3 ng / μL'ye seyreltin. 100 μL seyreltilmiş boğmaca toksinini 27 G'lik bir iğne ile 1 mL'lik Luer kilitli enjeksiyon şırıngasına aktarın.
3. Lewis Sıçanlarının Bağışıklanması
- 0. günde, emülsiyonu birkaç kez karıştırın. Tam Freund adjuvanında 1 mg lakrimal bez özütü ve 200 μg ovalbümin içeren emülsiyonun 200 μL'sini 27G iğneli 1 mL Luer kilitli şırıngalara dağıtın. Emülsiyonu anestezi olmadan sıçan kuyruklarının tabanına deri altına enjekte edin.
not: Enjeksiyondan önce kuyruğun önceden ısıtılmasına gerek yoktur. Her sıçan, 500 μg Mycobacterium tuberculosis H37Ra ile tam Freund adjuvanında 1 mg lakrimal bez ekstresi ve 200 μg ovalbümin ile aşılanır.
- 14. günde, 1 mg lakrimal bez özütü ve 200 μg ovalbümin içeren emülsiyonu, 0. gündeki gibi eksik Freund adjuvanına enjekte edin. Aynı gün sıçan başına intraperitoneal olarak 100 μL PBS'de 300 ng boğmaca toksini enjekte edin.
4. Antijen Karışımının Antijene Özgü Bağışıklık Hücrelerini İşe Almak ve Lokal İnflamasyona Neden Olmak için Forniceal Subkonjonktiva ve Lakrimal Beze Enjeksiyonu
- Deneydeki sıçan sayısına bağlı olarak ovalbümin ve lakrimal bez özütü miktarını hesaplayın. Gerekli miktarda ovalbümini tartın ve 1. adımda hazırlanan çözülmüş lakrimal bez özü ile birleştirin, 1 mg / mL ovalbümin ve 1 mg / mL lakrimal bez özü içeren antijen çözeltisi yapın.
- Sıçanları intraperitoneal enjeksiyon ile ketamin (75 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) ile anestezileştirin. Uygun anestezinin sağlandığından emin olmak için sıçanların ayak parmaklarını sıkıştırın (yani, çimdiklemeden sonra yanıt veren bir hareket gözlenmez). Gözün forniceal subkonjonktivasına 5 μL antijen enjekte edin. Lakrimal beze 20 μL antijen enjekte edin.
5. Kuru Göz Özelliklerinin Değerlendirilmesi
NOT: Anestezi uygulanan sıçanlar, hareketi önlemek için eldivenli bir el ile düz bir yüzey üzerinde dik pozisyonda nazikçe tutulmalıdır.
- Fenol kırmızı iplik ile yırtılma hacmini ölçün.
- İpliği tutmak için bir çift forseps ve farenin alt göz kapağını çekmek için başka bir forseps kullanın. İpliği 1 dakika boyunca alt forniksin proksimal köşesine yerleştirin ve ardından ipliği çıkarın.
not: Yırtıklar, ipliğin ıslanan kısmını kırmızı renkte yapar.
- Milimetre işaretli bir cetvelin yanındaki ipliğin ıslanan kısmının uzunluğunun bir görüntüsünü alın. Bir görüntü yazılımı (ör. ImageJ) kullanarak ıslanan uzunluğu milimetrenin onda birine kadar ölçün.
- Kornea / yırtılma düzgünlüğünü ölçün.
- Fareyi bir halka aydınlatıcı ve bir kamera ile donatılmış bir stereomikroskop altına yerleştirin. Sıçan korneasına 5 μL salin uygulayın. Tuzlu havayı yaymak için üst ve alt göz kapaklarını eldivenli parmaklarla ~ 5 kez hareket ettirerek pasif olarak göz kırpın.
- Halka aydınlatıcıyı 1,6x büyütme altında kornea yüzeyinin ortasına odaklayın. 10 s.
sonra fotoğrafik görüntüler elde edin
not: Halka aydınlatıcı, hayvanın kornealarına iki dairesel sıra nokta görüntüsü yansıtır. Bozulmamış noktaların düzenli aralığı, pürüzsüz bir kornea / gözyaşı tabakası olduğunu gösterir.
