Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Kanal Slaytlarında Periton Hücrelerinin Tohumlanması
- Topaklanmayı azaltmak için peritoneal fare makrofaj hücresi süspansiyonunu yukarı ve aşağı pipetledikten sonra, 100 μL süspansiyonu fibronektin kaplı bir kanal slaytının önceden doldurulmuş kanalına (hacim, 100 μL) pipetleyin (100 μL'lik bir kanalın boyutları vardır (uzunluk x genişlik x yükseklik): 50 mm x 5 mm 0,4 mm).
- Kanal slaytının iki rezervuarından birine 1 mL serum takviyeli RPMI 1640 (Hepes) ortamı ekleyerek, slaytı eğerek ve ardından ortamı aşağı akış rezervuarından aspire ederek hazneyi önceden doldurun (Şekil 1).
- İki rezervuardan birine 1-2 mL ortam ekleyerek, bir rezervuar kapağını sıkıca uygulayarak ve ardından kapağa ritmik başparmak basıncı uygulayarak havayı dışarı pompalayarak kanaldaki istenmeyen hava kabarcıklarını veya uzun hava şeritlerini çıkarın ve gerekirse sürgüyü eğin. Havayı dışarı attıktan sonra, havanın kanala geri çekilmesini önlemek için kapağı çıkarmadan önce kapağı açılmamış rezervuar (ve içeren ortam) ile sürgüyü aşağı doğru eğin.
- Hücrelerle tohumlanmış kanal slaytını, CO2 yokluğunda 37 ° C'de 2 saat nemli bir odada inkübe edin (HCO3- / CO2 tampon sistemi Hepes ile değiştirildiğinden CO2 gerekli değildir). Kanal kızakları, sekiz kızak tutan bir rafa uygun bir şekilde yerleştirilebilir. Tipik olarak, bir fareden 6-8 slayt hazırlanır, ancak 10 veya daha fazlası da mümkündür.
- Rafı çıkarın ve her slayttaki RPMI 1640 (Hepes) ortamını, %10 fetal sığır serumu ve ayrıca penisilin/streptomisin ile desteklenmiş bikarbonat içeren RPMI 1640 ortamı ile değiştirin.
- Sürgüyü ve aspire ortamını önce alt rezervuardan ve ardından üst rezervuardan eğin. Daha sonra, rezervuarlardan birine 1 mL yeni ortam ekleyin, slaytı eğin ve ortamı kanaldan aktıktan sonra aşağı akış rezervuarından aspire edin.
- Bu yıkama (orta değiştirme) adımından sonra, rezervuarlardan birine 1 mL orta ekleyerek kanal sürgüsünü doldurun.
not: Kanal kızakları kullanılarak yıkama adımları, çözelti değişimi ve yapışmayan hücrelerin uzaklaştırılması açısından çok basit ve etkilidir. RPMI 1640 (bikarbonat) ortamının, termal ve pH dengesini sağlamak için normalde gece boyunca %5 CO2 ile önceden inkübe edildiğini unutmayın.
- Hücreleri gece boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin. Ertesi gün deneyler yapın.
2. İnsan Kırmızı Kan Hücrelerinin İzolasyonu
- 2. günde (deneylerin ikinci günü; izole edilmiş peritoneal makrofajların gece boyunca inkübasyonundan sonra), sağlıklı bir donörden 1-2 mL periferik venöz kan toplayın, heparinize bir tüpe koyun. 1 mL'yi yuvarlak tabanlı 2.0 mL (polipropilen) mikrosantrifüj tüpüne aktarın, 18 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin (ampirik ayar) ve süpernatanı (plazma ve buffy kaplama) çıkarın.
- Sedimantasyonlu kırmızı kan hücrelerinin 100 μL'sini nazikçe aspire edin ve bu hacmi 1: 1'i modifiye RPMI 1640 (Hepes) ortamı (aşağıda açıklanmıştır) ile yuvarlak tabanlı 2.0 mL mikrosantrifüj tüpünde karıştırın. Tüpü "1:1" olarak etiketleyin.
not: Hücreleri izole ettikten sonra 2. günde (tahliller için) kullanılan RPMI 1640 (Hepes) ortamı, %10 ısıyla etkisiz hale getirilmiş fetal sığır serumu, penisilin (100 ünite/mL), streptomisin (100 μg/mL) ve 1 mM N- (2-merkaptopropionil)glisin (fototoksisiteyi azaltmak için) içerir. Bundan sonra, bu ortam "modifiye" RPMI 1640 (Hepes) ortamı olarak anılacaktır.
- 1: 1 seyreltilmiş kırmızı kan hücresi süspansiyonunun 4 μL'sini, 2.0 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne önceden pipetlenmiş 2 mL modifiye RPMI 1640 (Hepes) ortamına pipetleyin (bu adımı tekrarlayın, yani 2 tüp hazırlayın). Her tüpü "4:2000" olarak etiketleyin. "1:1" ve "4:2000" tüplerini buzun üzerine yerleştirin.
3. Makrofaj Plazma Membranının Etiketlenmesi
- Tohumlanmış kanal slaytlarını CO2 inkübatöründen çıkarın ve her slayttaki RPMI 1640 (bikarbonat) ortamını modifiye edilmiş bir RPMI 1640 (Hepes) ortamı ile değiştirin. Daha sonra, hücreleri CO2.
yokluğunda 37 ° C'de nemli bir odaya yerleştirin
not: Gece boyunca inkübasyon ve yıkamadan sonra, lenfositlerin çoğu kanaldan çıkarılır. Kalan yapışık hücrelerin çoğu, morfolojik olarak veya anti-F4/80 antikoru kullanılarak immünofloresan boyama ile tanımlanabilen makrofajlardır. Farede yerleşik peritoneal makrofajların yaklaşık% 95'i F4 / 80 pozitiftir.
- Floresan yeşil etiketli anti-fare F4/80 antikorunu (4 ° C'de saklanır) 1:40 oranında modifiye RPMI 1640 (Hepes) ortamında seyreltin. Bir slayt alın, eğin ve 100 μL antikor karışımını slaydın 100 μL kanalının açıklığına pipetleyin (damla damla) (bkz. Şekil 1). Aşağı akış rezervuarına akan aspire ortamı. Hücreleri 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin (nemlendirilmiş ortam, CO2 olmadan). Kuluçka süresi boyunca, insan kırmızı kan hücrelerini etiketleyin (bkz. Bölüm 5).
not: Yukarıda belirtildiği gibi, HCO3-/CO2 tampon sistemi Hepes ile değiştirildiği için CO2 gerekli değildir.
- 20 dakikalık inkübasyon süresinden sonra (bu süre zarfında insan kırmızı kan hücreleri boyanır ve opsonize edilir), rezervuarlardan birine 1 mL modifiye RPMI 1640 (Hepes) ortamı ekleyerek ve ortamı kanaldan aktıktan sonra aspire ederek slaytı yıkayın, slaytın eğilmesiyle kolaylaştırılır. Kısa süreli depolama için 1 mL ortam ekleyin veya bir deneye devam edin (yani, parçacıklarda pipetleme (opsonize kırmızı kan hücreleri) ve hızlandırılmış eğirme diski konfokal mikroskobu ile görüntüleme fagositozu).
4. İnsan Kırmızı Kan Hücrelerinin Plazma Zarını Etiketleme
- Yeşil floresan etiketli anti-F4/80 antikoru ile bir makrofaj slaytını inkübe ettikten hemen sonra insan kırmızı kan hücrelerinin etiketlenmesine başlayın (Bölüm 3.2'den sonra). Hafifçe karıştırdıktan sonra, "4:2000" tüplerinden birinden (bakınız Bölüm 2.3) 400 μL alın ve (yuvarlak tabanlı) 2.0 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne dağıtın. Süspansiyonun yaklaşık 37 °C'ye ısınması için zaman tanıyın (aşağıdaki paragrafa bakın). 0,4 μL turuncu/kırmızı floresan plazma membran boyası ekleyin (-20 °C'de saklanan alikotlar), karıştırın ve 37 °C'de 5 dk.
inkübe edin
not: Laminer akış başlığının içine yerleştirilen ısıtılmış bir alüminyum blok, slaytları hazırlarken ısı kaybını en aza indirmek için kullanışlıdır. Borular, ısıtma bloğunun delik kuyularına yerleştirilebilir ve ayrı veya entegre, ısıtılmış bir alüminyum levha bir çalışma alanı olarak işlev görebilir.
- 5 dakikalık inkübasyon süresinden sonra, 1600 μL modifiye RPMI 1640 (Hepes) ortamı (2.0 mL mikrosantrifüj tüpünü doldurmak için) ekleyerek ilk yıkama adımını hazırlayın.
- Tüpü 18 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin (ampirik ayar). Tüpün altındaki duvarda (yani merkez dışında) kompakt bir kırmızı pelet görünmelidir. Tüpü, pelet yukarı bakacak şekilde döndürün ve 1–1,5 mL'lik bir pipet ucu kullanarak tüm süpernatanı art arda (iki adımda) dikkatlice çıkarın.
- Süpernatanı aspire ettikten sonra, 2.000 μL modifiye RPMI 1640 (Hepes) ortamı ekleyin, karıştırın (hücreleri yeniden süspanse etmek için) ve yukarıdaki santrifüjleme ve süpernatan aspirasyon adımlarını tekrarlayın.
- Peletleri (plazma zarı lekelenmiş ve 2x yıkanmış kırmızı kan hücrelerinin) 400 μL modifiye RPMI 1640 (Hepes) ortamı ile yeniden süspanse edin. Tüpü PMS (plazma zarı lekesinin kısaltması) olarak etiketleyin.
not: Alternatif olarak, asidik pH'ta daha güçlü bir şekilde floresan hale gelen pH'a duyarlı bir rodamin türevinin süksinimidil esteri, insan kırmızı kan hücrelerini etiketlemek için kullanılabilir. Bu durumda, floresan yoğunluğu ayrıca parçacıklar içselleştirildikten sonra fagozom olgunlaşmasının bir ölçüsü olarak hizmet eder.
5. İnsan Kırmızı Kan Hücrelerinin Fare İmmünoglobulin G (IgG) ile Opsonizasyonu (Etiketleme)
- 1 μL fare (IgG2b) monoklonal (klon HIR2) anti-insan CD235a (1 mg/mL) antikorunu (-20 °C'de saklanır) PMS etiketli tüpe ekleyin (bakınız Bölüm 4.2-4.5), 400 μL ortamda süspanse edilmiş plazma zarı lekeli insan kırmızı kan hücreleri içerir. CD235a (glikoforin A olarak da bilinir), eritroid soyuna özgü bir zar sialoglikoproteinidir.
- 37 ° C'de 8 dakika inkübe edin. İnsan kırmızı kan hücrelerinin IgG ile opsonizasyonunun aglütinasyona (hücre topaklanması) neden olduğunu unutmayın. Aglütinasyon, opsonizasyonun görsel bir göstergesi olarak hizmet edebilse de, tek fagositik etkilerin görüntülenmesi için istenmeyen bir durumdur. Aglütinasyonu atlatmak için, örneğin 200 μL'ye ayarlanmış 20-200 μL hacimli değişken bir pipet kullanarak hücre süspansiyonunu (her 1 dakikada bir) tekrar tekrar karıştırın.
- 8 dakikalık inkübasyon süresinin sonuna doğru, istenirse yeşil floresan işaretli anti-F4/80 antikoru ile inkübe edilmiş makrofaj lamını 1 mL modifiye RPMI 1640 (Hepes) besiyeri ile yıkayınız. Yıkama adımlarından sonra kanal sürgüsünün her iki rezervuarının da ortamdan arınmış olduğundan emin olun.
>6. Plazma Membranı Lekeli ve IgG Kaplı İnsan Kırmızı Kan Hücrelerinin Fagositozunun Görüntülenmesi
- Anti-CD235a antikoru (Bölüm 5.2) ile 8 dakikalık inkübasyondan sonra, plazma zarı ile boyanmış ve IgG opsonize edilmiş insan kırmızı kan hücrelerini içeren 100 μL süspansiyonu, yeşil floresan anti-F4/80 antikoru ile etiketlenmiş makrofajlar içeren bir lamın kanalına pipetleyin (Adım 3). Böylece, kırmızı floresan, IgG-opsonize insan kırmızı kan hücreleri, yeşil floresan fagositlere (makrofajlar) eklenir.
- İnsan kırmızı kan hücreleri eklenir eklenmez, kanal slaytını örneğin 60X / 1.49 yağa daldırma objektif lensi aracılığıyla görüntüleme için dönen diskli bir konfokal mikroskoba (sahne inkübatörü 37 ° C'ye ayarlanmış olarak) monte edin. Parçacıklar 1 dakika içinde çökelmeye başladığı için mümkün olan en kısa sürede görüntülemeye <>
not: 100 nm çapında floresan boncuklar kullanarak, nokta yayılma fonksiyonlarının analizi ile x = 0.22 μm, y = 0.23 μm (488 nm lazer) ve x = 0.27 μm, y = 0.27 μm (561 nm lazer) XY çözünürlüklerini ölçtük. Bununla birlikte, canlı hücrelerin hızlandırılmış 3D görüntülemesi sırasında foto ağartmayı ve fototoksisiteyi azaltmak için 2 x 2 gruplama kullanarak uzamsal çözünürlükten ödün veriyoruz. Gruplama, hassasiyeti (sinyal-gürültü oranını iyileştirir) ve izin verilen kare hızını artırır, ancak uzamsal çözünürlük pahasına.
- Kayıtlar sırasında odak kaymasını önlemek için mükemmel bir odak (veya benzeri) sistemi kullanın. Mükemmel odak sistemini etkinleştirdikten sonra, kanal sürgüsünün lamel (aşağıdaki nota bakın) hemen üzerindeki makrofaj lamellipodial çıkıntılara odaklanmak için ofset kontrolünü kullanın. Bu odak seviyesi Z = 0 μm'ye karşılık gelir. 0,8 μm'lik adımlarla -1 μm ila +16 μm arasında Z yığınları elde edin, bu da 22 Z dilimine karşılık gelir. Z-yığınları, örneğin, her 15 saniyede bir toplam 16 dakika boyunca 1 yığın hızında (her kanal için) elde edilebilir.
not: Daha uzun kayıt süreleri, özellikle foto ağartma nedeniyle görüntü kalitesi kayıplarına maruz kalır. İki kanalın her biri için Z yığınları elde edilir: makrofajlar 488 nm lazer (yeşil kanal) kullanılarak görüntülenir ve insan kırmızı kan hücreleri 561 nm lazer (kırmızı kanal) kullanılarak görüntülenir. Bu yaklaşımı kullanarak, farklı zaman noktalarında IgG-opsonize insan kırmızı kan hücrelerini yutan makrofajların çeşitli görünümleri elde edilebilir (örneğin, bkz. Şekil 2).
not: Sistemin tipik ayarları (2 x 2 gruplama ile) şunlardır: yeşil kanal (%20,5 lazer (50 mW; 488 nm) gücü, 101 hassasiyet (aralık, 0–255) ve 200 ms pozlama süresi); kırmızı kanal (%10,5 lazer (50 mW; 561 nm) güç, 101 hassasiyet (aralık, 0-255) ve 98 ms pozlama süresi).
not: Kanal sürgüsünün alt kısmı, # 1.5 cam lamel ile aynı kalınlığa ve camın aynı optik özelliklerine sahip bir polimerdir, ancak özellikle, malzeme gaz geçirgenliği avantajına sahiptir.
