Kanser Hücrelerine Yönelik Doğal Öldürücü Hücre Aracılı Sitotoksisiteyi Değerlendirmek için Calcein Asetoksimetil Boyama

Özet

Kaynak: Chava, S. et al., Hepatik Tümör Hücreleri Bağlamında Doğal Öldürücü Hücre Aracılı Sitotoksisite ve Migrasyonun Ölçümü. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu video, Calcein boyası kullanılarak kanser hücrelerine karşı doğal öldürücü hücrelerin sitotoksisitesini ölçmek için yapılan bir testi göstermektedir. Doğal öldürücü hücrelerle ko-kültürü takiben floresan kanser hücrelerinin sayısının azalması, kanser hücrelerine karşı doğal öldürücü hücre aracılı sitotoksisiteyi gösterir.

Protokol

1. NK Hücre Aracılı Sitotoksisiteyi Ölçmek için Calcein Boyama Tabanlı Mikroskobik Yöntem

1. SK-HEP-1 hücrelerini% 70-80 birleşmeye kadar kültürleyin. Önce hücreleri 5 mL 1x PBS ile yıkayarak ve ardından 1 mL% 0.25 tripsin-EDTA ile inkübe ederek tek hücreli bir süspansiyon oluşturun.
2. SK-HEP-1 hücrelerini 1 mL steril santrifüj tüpünde 160 x g'da 3 dakika santrifüjleyin. Peletleri 3 mL serumsuz DMEM'de yeniden süspanse edin.
3. SK-HEP-1 hücrelerine 1.5 μL kalsein çözeltisi (10 mM) ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Kalsifein etiketli SK-HEP-1 hücrelerini 15 mL steril santrifüj tüpünde 3 dakika boyunca 160 x g'da santrifüjleyin.
4. Fazla kalsein boyasını çıkarmak için hücreleri 5 mL 1x PBS ile iki kez yıkayın.
5. Paralel olarak, NK92MI hücrelerini 15 mL'lik bir steril santrifüj tüpünde 3 dakika boyunca 160 x g'da santrifüjleyin. Hücre peletini 5 mL 1x PBS ile bir kez yıkayın ve 5 mL NK92MI hücre ortamında yeniden süspanse edin.
6. Bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak kalsein etiketli SK-HEP-1 hücrelerini ve NK92MI hücrelerini sayın.
7. Kültür ortamında SK-HEP-1 hücrelerini 1 x 10⁵ hücre / mL'de ve NK92MI hücrelerini NK hücre ortamında 1 x 10⁶ hücre / mL'de yeniden askıya alın.
8. Plaka kalsein etiketli SK-HEP-1 hücreleri (hedef hücreler) (1 x 10⁴/100 μL/kuyu) ile NK92MI hücreleri (efektör hücreler) (1 x 10⁵/100 μL/kuyucuk) (1:10 hedef: efektör oranı) 96 oyuklu bir plakadaki üçlü kuyucuklarda kuyu başına.
10. 
    
    

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Calcein boyası	Sigma-Aldrich	17783
DMEM (Ömer Çiçeğ	Gibco (Gibco)	11965-092
Fetal Sığır Serumu	Gibco (Gibco)	26140079
At Serumu	Gibco (Gibco)	16050114
NK92MI hücreleri	ATCC (Uzay Servisi)	CRL-2408
Fosfat Tampon Tuzlu Su (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417 Serisi
SKHEP-1 Hücreleri	ATCC (Uzay Servisi)	HTB-52
Tripsin EDTA çözeltisi	Gibco (Gibco)	25200056

Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi