Kemotaktik Uyaranlara Yanıt Olarak Doğal Öldürücü Hücre Migrasyonunun Ölçümü

Özet

Kaynak: Chava, S., et al. Hepatik Tümör Hücreleri Bağlamında Doğal Öldürücü Hücre Aracılı Sitotoksisite ve Migrasyonun Ölçümü. J. Vis. Uzm. (2020).

Bu videoda, kemoatraktanlara yanıt olarak gözenekli bir membran ekleme sistemi yoluyla doğal öldürücü (NK) hücre göçünü incelemek için bir yöntem gösterilmektedir. Bu yöntem, akış sitometrisi kullanılarak NK hücre göçünün kantitatif analizini sağlar.

Protokol

1. NK Hücre Migrasyon Testi

1. NK92MI hücrelerini ve santrifüj hücrelerini 15 mL steril santrifüj tüpünde 3 dakika boyunca 160 x g'da büyütün.
2. Hücre peletini 5 mL 1x PBS ile iki kez yıkayın ve hücreleri 3 mL serumsuz NK92MI hücre ortamında yeniden süspanse edin. Bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak NK92MI hücrelerini sayın.
3. Plaka NK92MI hücreleri (2.5 x 10⁵ hücre / 100 μL/kuyucuk) transwell geçirgen odasının üst bölmesinde (6.5 mm çaplı ek parça ve 5 μm gözenek boyutu).
4. Alt hazneye, NK hücresi kemoatraktan özellikleri (örneğin, şartlandırılmış ortam, kemokinler, sitokinler) için test edilecek materyali içeren 0.6 mL serumsuz ortam ekleyin.
   not: Şartlandırılmış ortam hazırlarken, migrasyon testinde serum proteinlerinden kaynaklanan etkileşimi ortadan kaldırmak için serum eklenmeden azaltılmış serum ortamı kullanın.
5. 24 iyi geçirgen odayı 37 ° C'de 4 saat inkübe edin. 4 saat sonra, yapışmayan ve göç eden NK92MI hücrelerini alt odadan toplayın ve daha fazla analiz için floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) tüplerine aktarın.
   not: Kültür süresi, hedef hücrelerin tipine ve hedef hücreler tarafından üretilen kemokinlerin miktarına ve kinetiğine bağlı olarak değişebilir. Bu nedenle, bu süre her hücre tipi, kemokin ve deney için ampirik olarak belirlenmelidir.
6. Göç etmiş NK hücreleri içeren her tüpe 50 μL'lik bir hacimde akış sitometrisi için önceden belirlenmiş sayıda sayma boncuğu ekleyin. Otomatik FACS tabanlı hücre sayımı yapabilen herhangi bir akış sitometresi kullanarak 300 μL/kuyu hücresi süspansiyonunun hacmini değerlendirin.
   not: Deneysel değişkenliği en aza indirmek için sabit sayıda boncuk kullanıldığından emin olmak için her kullanımdan önce akış sitometrisi için sayma boncuklarını iyice karıştırın veya girdapla karıştırın. Doğruluğu korumak için sayım tanecikleri ile ters pipetleme önerilir. FACS analiz kontrolleri olarak akış sitometrisi için yalnızca NK hücrelerini ve sayma boncuklarını kullanın. Yazarlar, en az 10.000 boncuk + NK hücresinin birlikte okunmasını tavsiye ediyor, bu da iyi çalışan bir miktar. Ancak bu sayı deney koşullarına bağlı olarak değişebilir. Bu nedenle, boncuk + NK hücrelerinin birleşik sayısı, her deney türü için ampirik olarak belirlenmelidir. Ek olarak, istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar elde etmek ve farklı hücre sayıları arasındaki değişkenliği hesaba katmak için biyolojik üçlüler kullanarak deneyler yapmak önemlidir.
7. Bu formülü kullanarak geçirilen NK92MI hücrelerinin mutlak sayısını hesaplayın:
   
   burada A = hücre sayısı, B = boncuk sayısı, C = partinin atanan boncuk sayısı (akış sitometrisi için boncuk sayma sayısı/50 μL; bu örnekte 49.500) ve D = numune hacmi (μL).
   not: Akış sitometrisi için 50 μL sayma boncuğu ile FACS analizi için 300 μL numune hacmi (göç etmiş hücreler) kullanılırsa, göç eden hücrelerin mutlak sayısı = 1.700 hücre / 3.300 boncuk olayı x 49.500 boncuk / 300 μL = 84.975 hücre / μL. Numune seyreltilmişse veya farklı bir hacimde FACS sayma boncuğu kullanılıyorsa hesaplama düzeltilmelidir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Mutlak sayma boncukları	Thermo Fisher Bilimsel	C36950
NK92MI hücreleri	ATCC (Uzay Servisi)	CRL-2408
SKHEP-1 Hücreleri	ATCC (Uzay Servisi)	HTB-52
Transwell geçirgen odalar	Yardımcı yıldız	3241
Opti-MEM	Gibco (Gibco)	31985070
Fosfat Tampon Tuzlu Su (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417 Serisi
Alfa-MEM	Sigma-Aldrich	M4256

Serisi Serisi Serisi Gazetesi Gazetesi Serisi