$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Kompleman ve Hedef Bakterileri Hazırlayın
- Yavru tavşan tamamlayıcısı hazırlayın (BRC)
NOT: Tamamlayıcı lot seçimi için ayrıntılı kriterler burada bulunabilir: https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf
- Dondurulmuş BRC elde edin ve akan soğuk su ile çözdürün. BRC'yi tamamen çözülene kadar her ~ 10-20 dakikada bir fiziksel olarak karıştırın. BRC'yi tekrarlanan donma-çözülme döngülerine maruz bırakmayın.
- BRC çözülürken 1,5 mL, 5 mL veya 15 mL santrifüj tüplerini etiketleyin. Ön soğutmak için etiketli tüpleri buzun üzerine yerleştirin. Önceden soğutulmuş santrifüj tüplerine uygun hacimde BRC ekleyin (doldurduktan sonra, her tüpü hemen buza geri koyun). Yiyecekleri ≤ -70 °C'de dondurucuda saklayın.
not: Her bir tahlil plakası için yaklaşık 1 mL kompleman gereklidir. Tamamlayıcı alikotlar tek kullanımlıktır ve tahlil düzenlerine uygun hacimlerde alıntılanmalıdır.
- Isı ile etkisiz hale getirilmiş BRC'yi hazırlamak için, aktif BRC'nin bir kısmını çözün. 56 °C'lik bir su banyosu hazırlayın. BRC tamamen çözüldükten sonra su banyosuna aktarın ve 30 dakika inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, ısıyla etkisiz hale getirilmiş BRC'yi su banyosundan çıkarın ve oda sıcaklığında (RT) 10-15 dakika soğumaya bırakın. Kuvvetlice karıştırın ve ~ 150 μL ila 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerini ayırın. Alikotları ≤ -10 °C'de saklayın.
- Hedef bakteri stoğunu hazırlayın
NOT: Aşağıdaki prosedür, hedef bakteri stoğunun 48 alikotunu hazırlamak için kullanılır; Daha fazla alikot gerekiyorsa, protokol ölçeklendirilebilir.
- Bakteri ana stok şişesini dondurucudan çıkarın ve şişeden az miktarda buzu bir kan agar plakasına çıkarmak için donmuş bakteri yüzeyini kazıyın. Ana stok şişesini hemen dondurucuya geri koyun.
- Bu küçük bakteri stoğu alikotunu kan agar plakasına sürün ve plaka kapağıyla örtün. Plakayı gece boyunca 37 °C /% 5 CO2 inkübatörde baş aşağı inkübe edin.
- ~ 10 izole edilmiş pürüzsüz koloniyi 30 mL LB suyu içeren 50 mL'lik bir tüpe aktarın. Kültür suyunun OD600'ü ~ 0.6-0.7 olana kadar hafifçe çalkalayarak 37 ° C'de 3-5 saat inkübe edin.
- Kültürün üst 12.5 mL'sini hasat edin ve 50 mL'lik taze bir tüpe aktarın. Masa üstü mikro santrifüj kullanarak kültürü 15.000 x g'da 2 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti 25 mL% 15 steril gliserol-LB içinde yeniden süspanse edin.
- İyice karıştırın ve 0.5 mL alikotları steril 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine (~ 48 tüp) dağıtın. Alikotları ≤ -70 °C'de dondurucuda saklayın.
- Kullanmadan önce aglütinasyon testini kullanarak bakteri kimliğini onaylayın.
- Hedef bakteri stoğu için optimal seyreltme faktörünün belirlenmesi
NOT: LB plakalarında ~120 CFU/nokta elde etmek için gerekli seyreltmeyi belirlemek için her bir hedef bakteri stoğu partisi test koşullarında titre edilmelidir.
- Bir mikrotitre plakası (Seyreltme Plakası) alın ve 1A kuyusuna 135 μL Test Tamponu ekleyin. 1B-1H kuyularına 120 μL Tahlil yağı ekleyin.
- Dondurucudan bir şişe donmuş hedef bakteri çıkarın ve oda sıcaklığında çözdürün. Bakteri stoğunun 10 kat seyreltilmesini sağlamak için 1A kuyusuna 15ul çözülmüş bakteri stoğu ekleyin.
- 5 kat seri seyreltme gerçekleştirmek için 30 μL bakteri çözeltisini kuyu 1A'dan kuyu 1B'ye aktarın. Toplam 8 seyreltme için 1H kuyusuna kadar 5 kat seri seyreltmeye devam edin (1:10; 1:50; 1:250; 1:1 250; 1:6 250; 1: 31 250; 1: 156 250; 1:781 250).
- Başka bir mikrotitre plakası (Tahlil Plakası) alın ve Tahlil Plakasındaki 1. ve 2. sütunlardaki tüm oyuklara 20 μL Test Tamponu ekleyin.
- Seyreltme plakasının 1. sütunundaki her bir oyuktan 10 μL seyreltilmiş bakteriyi Tahlil Plakasının 1. ve 2. sütunlarındaki ilgili kuyucuklara aktarın. 10 μL bakteri, seyreltme plakasının 1A kuyusundan Test Plakasındaki 1A ve 2A kuyusuna vb. aktarılır.
- Kontrol A ve Kontrol B, adım 3.6-3.12 için aşağıdaki Serum Bakterisidal Testinde (SBA) açıklandığı gibi teste devam edin.
- Plakalar buz üzerinde inkübe edildikten sonra, sütun 1'deki oyuklardan bir LBA plakasına 10 μL'yi tespit etmek için 8 pipet ucuna sahip çok kanallı bir pipet kullanın. Ayrıca, 2. sütundan LBA plakasına kadar olan kuyuları tespit edin.
- Aşağıda 3.14-4.6 adımlarında açıklandığı gibi teste devam edin.
- Kontrol B'de ~ 120 CFU / nokta veren bakteri seyreltmesini belirleyin, bu seyreltme testte kullanılacaktır.
2. Serum Bakterisidal Testi (SBA)
>NOT: Aşağıda açıklanan prosedür bir tahlil plakası içindir, ancak Tahlil Plakalarının sayısı artırılabilir.
- Numuneleri 56 °C'lik bir su banyosunda 30 dakika boyunca 30 dakika
inkübe ederek test numunelerini ısıyla etkisiz hale getirin
not: Test numuneleri, herhangi bir endojen kompleman aktivitesini iptal etmek için testten önce ısıyla inaktive edilmelidir. Bu, testten önce yapılabilir ve inaktive edilmiş numuneler yeniden dondurulabilir veya test edilene kadar 4 °C'de saklanabilir.
- Bir Tahlil Plakası alın ve A'dan G'ye kadar olan satırların 1 ila 12 arasındaki sütunlarına 20 μL Test Tamponu ekleyin. H satırının 1. ve 2. sütunlarına 20 μL Test Tamponu ekleyin, Tablo 1'e bakın.
- Her test numunesinden 30 μL'yi iki kopya halinde Tahlil Plakasının H satırına yükleyin. Örneğin, 30 μL numune 1'i 3H ve 4H kuyularına dağıtın ve 30 μL numune 2'yi 5H ve 6H kuyularına vb. dağıtın.
- Çok kanallı bir pipet kullanarak test numunelerinin 3 kat seri seyreltmelerini gerçekleştirin.
- Numunenin 10 μ 3H-12H kuyucuklarından çıkarın ve G sırasındaki ilgili kuyucuklara aktarın ve numuneyi 8-10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.
- Daha sonra 3G-12G kuyularından 10 μ çıkarın ve F sırasındaki ilgili kuyucuklara aktarın ve iyice karıştırın.
- Bu seri seyreltmelere A satırı boyunca devam edin. A sırasındaki kuyucukları karıştırdıktan sonra, tüm kuyucuklar 20 μl.
içerecek şekilde 3A-12A kuyularından 10 μl'yi çıkarın ve atın
not: Toplam 80 μL'lik bir tahlil hacminde 20 μL serum kullanıldığından, tahlilde 4 kat ek seyreltme vardır. Bu seyreltme, bir SBA titresinin hesaplanması sırasında, serumun seyreltilmesinin 4 ile çarpılmasıyla dikkate alınmalıdır. Örneğin, 1:2'lik bir başlangıç seyreltmesi kullanılıyorsa, test edilen gerçek seyreltme 1:8'dir.
- Bir şişe donmuş Hedef Bakteri Stoğunu çıkarın ve oda sıcaklığında çözdürün. Bakterileri önceden belirlenmiş optimal seyreltme faktörüne göre 20 mL Test Tamponu içinde seyreltin (bu seyreltme faktörü bölüm 1.3'te belirlenmiştir). Çok kanallı bir pipet kullanarak tahlil plakasının her bir oyuğuna 10 μL seyreltilmiş bakteri ekleyin.
- Bir şişe donmuş BRC ve bir şişe donmuş Isı ile etkisiz hale getirilmiş BRC'yi çıkarın, oda sıcaklığında akan soğuk su ile çözdürün veya hızlı bir şekilde çözülmesi için üfleme havası olan bir biyolojik güvenlik kabininin ızgarasına yerleştirin.
- % 20'lik bir ısıyla inaktive edilmiş BRC çözeltisi hazırlayın. 100 μL ısıyla inaktive edilmiş BRC'yi 400 μL Test Tamponu ile karıştırın. Bu %20'lik ısıyla inaktive edilmiş BRC çözeltisinden 50 μL'yi sütun 1'deki tüm kuyucuklara ekleyin (Kontrol A kuyuları).
not: Isı ile inaktive edilmiş BRC, tahlilde spesifik olmayan öldürmeyi (NSK) izlemek için bir kontrol olarak kullanılır.
- % 20'lik bir doğal BRC çözeltisi hazırlayın. 1 mL doğal BRC'yi 4 mL Test Tamponu ile karıştırın. Bu karışımdan 50 μL'yi 2'den 12'ye kadar olan sütunlardaki tüm kuyucuklara ekleyin (Kontrol B ve test numunesi kuyucukları).
not: Reaksiyon karışımındaki nihai BRC konsantrasyonu %12,5'tir.
- Tahlil Plakasını bir plaka çalkalayıcı üzerinde 10-15 saniye hafifçe çalkalayarak kısaca karıştırın veya çok kanallı bir pipet kullanarak 8 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
- Tahlil Plakasını 37 ° C'lik bir mikrobiyolojik inkübatöre 2 saat boyunca (sallamadan) koyun.
- Kapakları çıkararak ve plakaları yüzü yukarı bakacak şekilde biyolojik güvenlik kabinine 40-60 dakika yerleştirerek 2 LBA plakasını kurutun.
- 2 saatlik inkübasyon tamamlandığında, Test Plakasını ıslak buza getirin ve reaksiyonu durdurmak için 10-20 dakika inkübe edin.
- 12 kanallı bir pipet kullanarak, H sırasındaki kuyucukları karıştırın ve reaksiyon karışımının 10 μL'lik plakasını bir LBA plakasının dibine yerleştirin. Plakayı hemen eğin ve lekelerin ~ 1,5-2 cm boyunca akmasına izin verin. Bu prosedürü G, F ve E satırları için tekrarlayın ve bunları LBA plakasındaki önceki sıranın üzerinde bulun. E, F, G ve H satırları bir LBA plakasında ve A, B, C ve D satırları aynı şekilde ikinci bir LBA plakasında lekelenir, bkz. Şekil 1.
- Çözelti LBA plakalarına adsorbe edilene kadar (10-15 dakika) LBA plakalarını oda sıcaklığında inkübe edin. Kapakları LBA plakalarının üzerine yerleştirin ve LBA plakalarını gece boyunca (~ 16-18 saat) inkübe etmek için mikrobiyolojik inkübatöre baş aşağı yerleştirin. Shigella flexneri 2a ve 3a'yı 29 °C'de inkübe edin ve S. sonnei'yi 26 °C'de inkübe edin.
not: Bu sıcaklıklar, bir koloni sayacı9 tarafından doğru sayım için uygun boyutlara sahip daha küçük "mikro koloniler" verir.
- Gece boyunca inkübasyondan sonra, her bir LBA plakasına 100 μg / mL TTC ve% 0.1 NaN3 içeren 25 mL Overlay Agar (~ 55 ° C'de) ekleyin.
- Hayatta kalan bakterilerin kırmızı bir renk geliştirmesine izin vermek için LBA plakalarını 37 ° C'de 2 saat inkübe edin, aşağıdaki Şekil 1'e bakın.
- Plakaları bir dijital kamera kullanarak fotoğraflayın ve görüntüleri NIST'in Entegre Koloni Numaralandırma Yazılımının (NICE) kurulu olduğu bir bilgisayara aktarın, bkz. Şekil 2.
not: NICE koloni sayma yazılımı ücretsiz olarak mevcuttur. Ayrıntılar ve kurulum talimatları için Malzeme Listesine bakın.
Tablo 1: Test plakası düzeni. Sütun 1 ve 2, kompleman kontrol kuyularını içerir. Kontrol A, sütun 1'de bulunur ve SBA tamponu, bakteri ve ısıyla inaktive edilmiş kompleman içeren ısıyla inaktive edilmiş kompleman kontrolüdür. Kontrol B, sütun 2'de bulunur ve SBA tamponu, bakteri ve kompleman içeren aktif kompleman kontrolüdür. Sütun 3-12 serum örneklerini içerir. Her numune iki kopya halinde çalıştırılır ve H satırından A satırına 3 kat seri olarak seyreltilir
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| Bir | Kontrol A | Kontrol B | Seyreltme 8 | Seyreltme 8 | Seyreltme 8 | Seyreltme 8 | Seyreltme 8 | Seyreltme 8 | Seyreltme 8 | Seyreltme 8 | Seyreltme 8 | Seyreltme 8 |
| B | Kontrol A | Kontrol B | Seyreltme 7 | Seyreltme 7 | Seyreltme 7 | Seyreltme 7 | Seyreltme 7 | Seyreltme 7 | Seyreltme 7 | Seyreltme 7 | Seyreltme 7 | Seyreltme 7 |
| Ç | Kontrol A | Kontrol B | Seyreltme 6 | Seyreltme 6 | Seyreltme 6 | Seyreltme 6 | Seyreltme 6 | Seyreltme 6 | Seyreltme 6 | Seyreltme 6 | Seyreltme 6 | Seyreltme 6 |
| D | Kontrol A | Kontrol B | Seyreltme 5 | Seyreltme 5 | Seyreltme 5 | Seyreltme 5 | Seyreltme 5 | Seyreltme 5 | Seyreltme 5 | Seyreltme 5 | Seyreltme 5 | Seyreltme 5 |
| E | Kontrol A | Kontrol B | Seyreltme 4 | Seyreltme 4 | Seyreltme 4 | Seyreltme 4 | Seyreltme 4 | Seyreltme 4 | Seyreltme 4 | Seyreltme 4 | Seyreltme 4 | Seyreltme 4 |
| F | Kontrol A | Kontrol B | Seyreltme 3 | Seyreltme 3 | Seyreltme 3 | Seyreltme 3 | Seyreltme 3 | Seyreltme 3 | Seyreltme 3 | Seyreltme 3 | Seyreltme 3 | Seyreltme 3 |
| G | Kontrol A | Kontrol B | Seyreltme 2 | Seyreltme 2 | Seyreltme 2 | Seyreltme 2 | Seyreltme 2 | Seyreltme 2 | Seyreltme 2 | Seyreltme 2 | Seyreltme 2 | Seyreltme 2 |
| H | Kontrol A | Kontrol B | Seyreltme 1 | Seyreltme 1 | Seyreltme 1 | Seyreltme 1 | Seyreltme 1 | Seyreltme 1 | Seyreltme 1 | Seyreltme 1 | Seyreltme 1 | Seyreltme 1 |
| | | Örnek 1 | Örnek 2 | Örnek 3 | Örnek 4 | Örnek 5 |
