$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. CFSE işaretli apoptotik timositlerin hazırlanması
- İki saf C57 / B6 faresini 10 dakika boyunca CO2 soluyarak ötenazi yapın ve göğüs boşluğunu açmak için inceleyin, timusu kavisli ince uçlu forsepslerle 10 mL RPMI1640 ortamı içeren doku kültürü petri kabına çıkarın (dışarı çekin).
- Tüm timusu mikroskop slaytlarının iki buzlu ucuna karşı öğüterek tek hücreli süspansiyon elde edin ve ardından süspansiyonu 100 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün
.
- 10 mL timus süspansiyonunu 50 mL'lik bir tüpe toplayın ve 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı çıkarın, 40 mL 1x PBS'de yeniden süspanse edin ve bir hemositometre ile hücre sayılarını sayın.
- 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
- 2 x 108 hücreye kadar tek hücreli bir süspansiyon olarak 50 mL'lik bir tüpte 20 mL 1x PBS'de yeniden süspansiyon yapın (2 x 108 hücreden fazla ise, hücrelerin geri kalanını başka bir 20 mL 1 x PBS'de yeniden süspanse edin farklı bir 50 mL tüpte).
- 40 μL CFSE stok solüsyonunu (2,5 mM) 20 mL 1x PBS'ye pipetleyerek ayrı bir 50 mL'lik tüpte eşit hacimde (20 mL) 1x PBS'de 5 μM CFSE yapın ve tüpü 2-3 kez ters çevirerek iyice karıştırın.
- Adım 1.7'den 20 mL CFSE'yi, adım 1.6'dan 20 mL hücre süspansiyonuna ekleyin (CFSE'nin nihai konsantrasyonu şimdi 2.5 μM'dir).
not: Her 20 mL hücre süspansiyonu için 20 mL'lik bir CFSE tüpüne ihtiyaç vardır.
- Hücreyi ve CFSE karışım tüpünü 2-3 kez ters çevirin ve karışımı karanlıkta oda sıcaklığında en fazla 2 dakika inkübe edin, ardından 10 mL ısıyla inaktive edilmiş at serumu ekleyerek reaksiyonu durdurun.
- 50 mL tüp karışımını oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
not: CFSE etiketlemesi başarılı olursa, hücre peleti açık sarı olur.
- Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 40 mL 1x PBS'de yeniden süspanse edin ve bir hemositometre ile hücre sayılarını sayın.
- Hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
- Hücre peletini tekrar 40 mL RPMI1640 besiyeri ile yıkayın.
- Süpernatanı çıkarın ve hücreleri 100 mm'lik RPMI1640 doku kültürü kabında 7 x 106 hücre/mL konsantrasyonda doku kültürü ortamı (RPMI1640, 20 mM HEPES, %10 FBS (ısı ile etkisizleştirilmiş), 20 mM glutamin ve 1x Pen/Strep) ile yeniden süspanse edin.
not: Daha fazla hücre elde edilirse, ayrı bir 100 mm doku kültürü kabına ihtiyaç duyulacaktır.
- 1 μM'lik bir nihai konsantrasyonda hücre süspansiyon kültürüne staurosporin ekleyin ve %5 CO2 ile sağlanan bir doku kültürü inkübatöründe 37 ° C'de 4 saat boyuncakültürleyin.
2. Peritoneal makrofajların hazırlanması
- İki C57B6 faresine (veya laboratuvarda genle manipüle edilmiş herhangi bir fareye) 0. günde 1 mL% 3 yaşlı tiyoglikolat ile intraperitoneal olarak enjekte edin.
- Fareleri adım 1.1'de olduğu gibi 5. günde ötenazi yapın, karın derisini kesin ve soyun, ancak peritonu sağlam bırakın. 18 G'lik bir iğneye bağlı 10 mL'lik bir şırınga kullanarak 10 mL yıkama tamponunu (RPMI1640, %2 FBS, %0.04 EDTA) periton boşluğuna hızla iterek periton boşluğunu yıkayın.
- Yıkama tamponunu aynı iğne / şırınga ile yavaşça alın ve yıkama tamponunu 50 mL'lik bir tüpe toplayın.
- Periton gavajını 1x PBS ile iki kez yıkayın, peritoneal makrofajları 2 x 106 hücre / mL yoğunlukta RPMI1640 doku kültürü ortamında yeniden süspanse edin ve 24 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 500 μL alikot edin. Plakayı 2 saat boyunca bir doku kültürü inkübatöründe bırakın.
- Yüzen hücreleri aspire ederek ve iki kez 500 μL taze kültür ortamı ile değiştirerek çıkarın.
- İsteğe bağlı olarak, TAM reseptörü tirozin inhibitörü, RXDX-106'yı şekil açıklamalarında belirtilen konsantrasyonlarda makrofaj kültürünün her bir oyuğuna ekleyin ve 2 saat daha inkübe edin.
3. Peritoneal makrofajların apoptotik timositlerle ko-kültürü
- 1. adımdan itibaren apoptotik timositleri toplayın ve RPMI1640 besiyeri ile üç kez yıkayın. Apoptotik indüksiyonun etkinliği bu aşamada Annexin V/7-AAD kiti ile ölçülebilir.
- Deneysel düzenlemeye göre protokol #2'deki makrofaj kültürlerinin her bir oyuğuna 0 - 12 x 106 hücre (500 μL ortamda) dağıtın (örneğin, bkz. Şekil 1). Bu, 24 oyuklu plakanın her bir oyuğunda tüm kültür hacmini 1 mL'lik yapar. Apoptotik timositlerin eklenmesinden hemen önce bloke edici antikoru kültüre ekleyin.
- Hücre karışımını 37 ° C'de 4 saat boyunca% 5 CO2 ile sağlanan bir doku kültürü inkübatöründe kültürleyin.
- Serbest yüzen apoptotik hücreleri çıkarmak için kültürün her bir kuyusunu 1x PBS (500 μM EDTA içeren) ile iki kez yıkayın.
- Bu aşamada plakaya bağlı makrofajları CD11b-PE ile boyayın.
- Plakaya bağlı makrofajları bir boyama tamponu (1x PBS,% 1 BSA) ile bir kez yıkayın.
- Her oyuğa 2 μL CD11b-PE içeren 200 μL boyama tamponu ekleyin.
- Plakayı 4 °C'de 20 dakika inkübe edin.
- Plakanın her bir kuyusunu boyama tamponu ile üç kez yıkayın.
- 200 μL boyama tamponu ekleyin ve floresan mikroskobu altında görüntü analizi için plaka ile devam edin.
