$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. HMDM'nin polarizasyonu
- Steril koşullar altında, tam RPMI-1 kültür ortamına interferon γ (IFNγ; 20 ng/mL) ve lipopolisakkarit (LPS; 1 μg/mL) ekleyerek M1640 hazırlama ortamını hazırlayın. Tam RPMI-2 kültür ortamına interlökin 4 (IL-4; 20 ng/mL) ekleyerek M1640 hazırlama ortamını hazırlayın.
- Steril koşullar altında, bölüm 1'de tarif edildiği gibi tohumlanmış ve kültürlenmiş İnsan monositinden türetilmiş makrofajları, HMDM'yi içeren doku kültürü plakası kuyucuklarından aspire edin.
- Hücreleri 3x içeren kuyucukları steril PBS (önceden 37 ° C'ye ısıtılmış) ile 1 mL PBS alikotları kullanarak dikkatlice yıkayın.
- HMDM'yi içeren her bir oyuğa (deney için hangisi uygunsa) 1 mL M1 veya M2 hazırlama ortamı ekleyin.
- Hücreleri, bir hücre inkübatöründe% 5 CO2 varlığında 37 ° C'de 48 saat inkübe edin.
2. MET Salınımını indüklemek için HMDM'nin uyarılması
- Steril koşullar altında, makrofaj hücre dışı tuzaklar MET salınımının farklı uyarıcılarını içeren kültür ortamını (deney için hangisi uygunsa) tam RPMI-1640 ortamına hazırlayın: PMA (25 nM), insan rekombinant TNFa (25 ng / mL) veya insan rekombinant IL-8 (50 ng / mL).
- Hipokloröz asit, HOCl stimülasyonu ile yapılan deneyler için, hücrelere eklenmeden hemen önce HBSS'de (37 ° C'ye önceden ısıtılmış) HOCl'yi (200 μM) hazırlayın. HOCl'nin tam hücre ortamında hazırlanmadığından emin olun.
not: HOCl'nin stok çözeltisinin konsantrasyonu, çözeltinin UV absorbansı 292 nm ve pH = 11:6'da ölçülerek ve 350 M-1 cm-1'lik bir sönme katsayısı kullanılarak ölçülür.
- Bölüm 2'de tarif edilen polarizasyon işleminden sonra, hücre ortamını her bir oyuktan aspire edin ve hücreleri 3x'i aşağıdakilerden birinin 1 mL'lik alikotlarıyla dikkatlice yıkayın: steril PBS (PMA, TNFa ve IL-8 için) veya HBSS (HOCl için), 37 ° C'ye önceden ısıtılmış.
- PMA, TNFa veya IL-8 ile yapılan deneyler için: son yıkama adımında PBS'yi çıkardıktan sonra PMA, TNFa veya IL-8 içeren tam ortamdan 1 mL ekleyin.
- TNFa ile yapılan deneyler için, hücreleri bir hücre inkübatöründe% 5 CO2 varlığında 37 ° C'de 6 saat inkübe edin. PMA ve IL-8 ile yapılan deneyler için, hücreleri bir hücre inkübatöründe% 5 CO2 varlığında 37 ° C'de 24 saat inkübe edin.
- HOCl ile yapılan deneyler için, son yıkama adımında HBSS'yi çıkardıktan sonra HBSS'ye 1 mL HOCl ekleyin. Daha sonra, hücreleri bir hücre inkübatöründe% 5 CO2 varlığında 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
- Hücre süpernatanını dikkatlice aspire edin ve hücreleri 3x'i adım 2.3'te tarif edildiği gibi 1 mL HBSS alikotu ile yıkayın.
- HBSS'yi son yıkama adımından çıkardıktan sonra, 1 mL tam RPMI-1640 kültür ortamı ekleyin. Daha sonra, hücreleri bir hücre inkübatöründe% 5 CO2 varlığında 37 ° C'de 24 saat inkübe edin.
3. Canlı Hücre Kültüründe MET'in Görselleştirilmesi
- SYTOX yeşil boyayı HBSS'de 40 μM konsantrasyonda hazırlayın.
- MET salınımını indüklemek için bölüm 2'de açıklanan işlemlerin sonunda, HMDM içeren her bir oyuğa doğrudan 25 μL 40 μM boya ekleyin.
- Hücreleri karanlıkta 5 dakika oda sıcaklığında (RT) inkübe edin.
- HMDM'yi, görüntüleme için ters çevrilmiş bir floresan mikroskobun mikroskop aşamasındaki doku kültürü kuyularına yerleştirin.
- Mikroskop prosedürleri
- Geniş spektrumlu bir floresan ışık kaynağını, parlak alan ışık kaynağını ve yüksek çözünürlüklü renkli dijital kamerayla donatılmış ters çevrilmiş mikroskobu açın (Malzeme Tablosuna bakın).
- Doku kültürü kuyucuklarında bulunan yeşil lekeli numunelerin görüntülenmesi için yeşil floresan (uyarma = 504 nm, emisyon = 523 nm) için filtre çarkını "2 numara" konumuna çevirin.
- 5x objektifi kullanarak, mikroskop merceğinden bakıldığında görüntü keskin, net ve odaklanmış görünene kadar görüntüyü kaba odakla, ardından ince odak düğmeleriyle mikroskop üzerinde odaklayın.
- Mikroskobu kamera moduna geçirin.
- İlgili yazılımı başlatın.
- seçin Ele geçirmek yazılımdaki sekme.
- Görüntüyü önizlemek için Oynat düğmesine tıklayın ve görüntü yazılım önizleme penceresinde keskin, net ve odaklanmış görünene kadar mikroskop üzerindeki ince odak düğmesini ayarlayın.
- Yakala düğmesini tıklayın.
not: Yakalanan görüntü, beraberindeki yazılımda otomatik olarak görüntülenecektir.
- Yazılım içinde, tıklayın Dosya | Gerekli görüntü dosyası türü olarak kaydedin.
- Mikroskopta, parlak alan görüntüleme için filtre çarkını "5 numara" konumuna çevirin ve karşılık gelen parlak alan görüntüsünü elde etmek için 3.5.2–3.5.9 adımlarını tekrarlayın.
- Sonraki görüntü alımı için 3.5.2–3.5.10 adımlarını gerektiği kadar tekrarlayın.