İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. İnsan polimorfonükleer lökositlerinin saflaştırılması ve insan serumunun izolasyonu
>NOT: Tüm reaktifler, ticari olarak temin edilebilen bir endotoksin tespit kiti kullanılarak endotoksin varlığı açısından rutin olarak kontrol edilmeli ve PMN
- 50 mL %3 dekstran-%0.9 NaCl (a/h), 35 mL %0.9 NaCl (a/h), 20 mL %1.8 NaCl (a/h), 12 mL 1.077 g/mL yoğunluk gradyan çözeltisi ve 20 mL enjeksiyon veya sulama dereceli su oda sıcaklığına.
- İnsan serumunu izole etmek için, antikoagülan olmadan 4 mL taze çekilmiş insan kanını 37 ° C'de 15 mL'lik bir cam tüpte 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 2.000-3.000 × g'da santrifüjleyin. Üst serum tabakasını 15 mL'lik taze bir konik santrifüj tüpüne aktarın ve buzun üzerine yerleştirin.
- 25 mL taze çekilmiş heparinize (1000 ünite / mL) tam insan kanını 25 mL oda sıcaklığında% 3 dekstran-% 0.9 NaCl (1: 1 oranında) ile iki kopya 50 mL konik santrifüj tüpünde birleştirin (tüp başına 50 mL toplam hacim). Her 50 mL konik tüpü hafifçe sallayarak karıştırın ve ardından oda sıcaklığında 30 dakika bekletin.
- Oda sıcaklığında inkübasyondan sonra, iki ayrı katman görünecektir. Her bir dekstran-kan karışımının üst tabakasını yeni 50 mL'lik konik tüplere aktarın ve 450 x g'da oda sıcaklığında 10 dakika boyunca düşük frenli veya frensiz santrifüjleyin.
- Her iki süpernatanı da dikkatlice aspire edin ve hücre peletlerini bozmadan atın. Her hücre peletini 2 mL oda sıcaklığında %0.9 NaCl'de nazikçe yeniden süspanse edin, yeniden süspanse edilmiş peletleri tek bir 50 mL konik tüpte birleştirin, ardından kalan %0.9 NaCl'yi (35 mL'lik son hacim) ekleyin.
- Bir el pipeti kullanarak hücre süspansiyonunun altına 10 mL oda sıcaklığında 1.077 g / mL yoğunluk gradyan solüsyonunu dikkatlice yerleştirin. Düşük frenlerle veya hiç frensiz oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 450 x g'da döndürün. Hücre peletini bozmadan süpernatanı nazikçe aspire edin. Süpernatant, daha önce tarif edildiği gibi toplanabilen periferik kan mononükleer hücreleri içerecektir.
- Hücre peletini 20 mL oda sıcaklığında suda yeniden süspanse ederek kırmızı kan hücrelerini parçalayın. Tüpü 30 saniye sallayarak hafifçe karıştırın. Kırmızı kan hücrelerinin parçalanmasına, bulanıklıkta belirgin bir azalma eşlik edecektir.
- Hemen 20 mL %1.8 NaCl ekleyin (oda sıcaklığında [RT]) ve numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 450 × g'da santrifüjleyin.
not: PMN verimini en üst düzeye çıkarmak ve PMN lizizini ve / veya aktivasyonunu önlemek için kırmızı kan hücresi lizizini takiben PMN'lerin suda yalnız kaldığı süreyi en aza indirmek önemlidir.
- Hücre peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice aspire edin. Hücre peletini 2 mL RT RPMI 1640 ortamında nazikçe yeniden süspanse edin ve buzun üzerine yerleştirin.
- Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Saflaştırılmış PMN'leri buz gibi RPMI ile 1 x 107 hücre / mL konsantrasyonda yeniden askıya alın ve buz üzerinde tutun.
- 100 μL saflaştırılmış PMN'leri (1 x 106 hücreli) 300 μL buz gibi soğuk Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) ile iki replike akış sitometri tüpünde 1 μL propidyum iyodür boyası içeren birleştirin. Plazma zarı hasarı için pozitif bir kontrol için, akış sitometri tüplerinden birine 40 μL% 0.5 Triton X-100 çözeltisi ekleyin ve iyice karıştırın.
- Saflaştırılmış hücrelerin ileri saçılımını, yan saçılımını ve propidyum iyodür boyamasını (535/617 nm'de uyarma/emisyon maksimumları) ölçmek için akış sitometrisi kullanın (Şekil 1).
not: İleri ve yan saçılma analizi, istenmeyen lenfosit ve monosit popülasyonlarını belirleyecektir. Propidyum iyodür, yalnızca bozulmuş bir plazma zarına sahip hücreleri boyayacaktır ve propidyum iyodür pozitif hücrelerin belirgin popülasyonlarına sahip saflaştırılmış PMN'ler kullanılmamalıdır. Bu çalışmalar için, saflaştırılmış PMN'ler yalnızca saflaştırılmış hücrelerin %>98'ini içeriyorsa ve propidyum iyodür için pozitif olarak boyanmış %<5'i durumunda kullanılmıştır.
- Bu testte kullanılacak tek tek kuyucukları DPBS ile seyreltilmiş 100 μL% 20 izole insan serumu ile kaplayarak PMN sitotoksisite testleri için 96 oyuklu bir plaka hazırlayın.
not: PMN'lerin doğrudan plastik veya cam üzerine kaplanması hücrelerin aktivasyonuna neden olacaktır. Yalnızca medya alacak en az bir negatif kontrol kuyusu ve% 0.05 Triton X-100 alacak en az bir pozitif kontrol kuyusu eklediğinizden emin olun.
- Plakayı 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, fazla serumu çıkarmak için kaplanmış kuyucukları buz gibi soğuk DPBS ile iki kez yıkayın. Kalan DPBS'yi çıkarmak ve buzun üzerine yerleştirmek için plakayı hafifçe baş aşağı vurun.
- Her kaplanmış oyuğa (1 x 106 PMN / kuyucuk) 1 x 107 hücre / mL'de 100 μL saflaştırılmış insan PMN'leri ekleyin. Plakayı buz üzerinde en az 5 dakika inkübe ederek PMN'lerin kuyucuklara yerleşmesine izin verin. Her bir oyuktaki hücrelerin eşit dağılımına izin vermek için plaka seviyesini koruyun ve PMN'lerin istenmeyen aktivasyonunu önlemek için buz üzerinde bırakın.
2. S. aureus hücre dışı proteinlerin insan polimorfonükleer lökositlerine karşı sitotoksisite deneyi
- Kültür S. aureus, 37 ° C'ye ayarlanmış bir çalkalama inkübatörü kullanarak triptik soya suyunda (TSB) gece boyunca. Bu çalışmalar için, ayrı 150 mL Erlenmeyer şişelerinde 20 mL TSB, S. aureus suşları USA300 veya USA300ΔsaeR/S'nin donmuş kültürleri ile aşılandı ve 250 rpm'de çalkalanarak yaklaşık 14 saat büyütüldü.
- Alt kültür S. aureus, gece boyunca bakteri kültürünün taze ortam ile 1:100 oranında seyreltilmesiyle. Bakteriler erken durağan büyüme aşamasına ulaşana kadar çalkalayarak 37 °C'de inkübe edin.
not: Bu deneyler için, 150 mL Erlenmeyer şişelerinde 20 mL triptik soya suyu, 200 μL gece boyunca kültürlenmiş USA300 veya USA300ΔsaeR/S ile aşılandı ve 37 °C'de 5 saat boyunca 250 rpm'de çalkalanarak inkübe edildi.
- Bakteriler erken durağan büyüme aşamasına ulaştığında, 1 mL alt kültürlenmiş S. aureus'u 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 5.000 × g'da santrifüjleyin.
- Santrifüjlemeyi takiben, süpernatanı 3 mL'lik bir şırıngaya aktarın. Süpernatanları 0,22 μm'lik bir filtreden ve buz üzerinde yeni bir 1,5 mL'lik mikrosantrifüj tüpüne geçirin.
- S. aureus.
kültürlemek için kullanılan buz gibi soğuk ortamla süpernatanların seri seyreltmelerini gerçekleştirin
not: Gösterilen deneyler için, USA300 ve USA300ΔsaeR/S'den gelen süpernatantlar, buz gibi TSB ile dört ardışık 1/2 log seyreltmeye tabi tutuldu.
- Adım 1.15'ten itibaren buz üzerinde PMN'ler içeren 96 oyuklu plakaların tek tek kuyucuklarına nazikçe süpernatan numuneler veya tek başına ortam ekleyin. Bu deneyler için, her oyuğa 10 μL USA300 veya USA300ΔsaeR/S süpernatant numuneleri eklendi. Süpernatanları kuyucuklara dağıtmak ve 37 °C'de inkübe etmek için hafifçe kaya plakası.
- İstenilen zamanlarda, plakayı inkübatörden çıkarın ve buzun üzerine yerleştirin. Pozitif kontrol kuyusuna 40 μL% 0.5 Triton X-100 ekleyin.
- Plakaya yapışan tüm PMN'leri tamamen çıkarmak için numuneleri her bir oyukta yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin, ardından numuneleri 1 μL propidyum iyodür ile 300 μL buz gibi soğuk DPBS içeren buz üzerindeki akış sitometri tüplerine aktarın.
- Akış sitometrisi kullanarak propidyum iyodür pozitif PMN'lerin oranını ölçün (Şekil 2A). DNA'ya bağlandığında, propidyum iyodür 535/617 nm'de uyarılma/emisyona sahiptir.
