Fagositozu Takiben Nötrofiller Üzerinde Staphylococcus aureus Suşlarının Sitotoksisite Testi

Özet

Kaynak: Dankoff, J. G. ve diğerleri, Staphylococcus aureus'un İnsan Polimorfonükleer Lökositlerine Karşı Sitotoksisitesinin Ölçülmesi. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu videoda, akış sitometrisi kullanarak fagositozu takiben insan nötrofillerine karşı virülan ve daha az virülan Staphylococcus aureus suşlarının sitotoksisitesini tespit etmek için bir test gösteriyoruz.

Protokol

1. Fagositozu takiben insan polimorfonükleer lökositlerine karşı S. aureus sitotoksisite deneyi

NOT: Bu teste başlamadan önce test edilecek S. aureus suşları için 600 nm'deki (OD600) optik yoğunluk ve bakteri konsantrasyonu ile tanımlanan büyüme eğrileri ampirik olarak belirlenmelidir. Bu deneylerin başarısı, alt kültürlenmiş bakterilerin OD600'ü kullanılarak orta üstel büyüme aşamasında test edilen her bir S. aureus suşunun eşit konsantrasyonlarının tutarlı bir şekilde toplanmasını gerektirir.

1. Aşağıda tarif edildiği gibi S. aureus suşlarının ve alt kültür bakterilerinin gece boyunca kültürlerini başlatın.
   1. Kültür S. aureus, 37 ° C'ye ayarlanmış bir çalkalama inkübatörü kullanarak triptik soya suyunda (TSB) gece boyunca. Bu çalışmalar için, ayrı 150 mL Erlenmeyer şişelerinde 20 mL TSB, S. aureus suşları USA300 veya USA300ΔsaeR/S'nin donmuş kültürleri ile aşılandı ve 250 rpm'de çalkalanarak yaklaşık 14 saat büyütüldü.
   2. Alt kültür S. aureus, gece boyunca bakteri kültürünün taze ortam ile 1:100 oranında seyreltilmesiyle. 37 °C'de çalkalanarak inkübe edin.
2. 1 mL kültürlenmiş bakteriyi 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktararak ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 5.000 × g'da santrifüjleyerek orta üstel büyümeye ulaştığında alt kültürlenmiş S. aureus'u hasat edin.
   not: Büyüme koşullarımız altında, USA300 ve USA300ΔsaeR/S, yaklaşık 135 dakikalık inkübasyondan sonra orta üstel büyüme aşamasına ulaştı.
3. Santrifüjlemeyi takiben süpernatanı aspire ederek, peletlenmiş bakterileri 1 mL DPBS'de yeniden süspanse ederek, numuneyi 30 saniye vorteksleyerek ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 5.000 × g'da santrifüjleyerek yıkayın.
4. Opsonize S. aureus bakteri peletini DPBS ile seyreltilmiş 1 mL% 20 insan serumu içinde yeniden süspanse ederek ve 37 ° C'de 15 dakika çalkalayarak inkübe ederek.
5. Opsonize bakterileri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 5.000 x g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben S. aureus'u süpernatanı aspire ederek, peletlenmiş bakterileri 1 mL DPBS'de yeniden süspanse ederek ve ardından bakteri peleti tamamen parçalanana kadar ve 30 saniye daha girdaplayarak yıkayın. Bakterileri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 5.000 × g'da santrifüjleyin.
6. Opsonize S. aureus suşlarını 1 mL RPM'de yeniden süspanse edin, bakteri peleti tamamen parçalanana kadar numuneyi girdaplayın ve ardından 30 saniye daha bakterileri buzun üzerine yerleştirin.
7. Opsonize S. aureus suşlarını buz gibi soğuk RPMI ile istenen konsantrasyona seyreltin. 30 saniye boyunca girdap yapın ve buzun üzerine yerleştirin.
8. Opsonize S. aureus konsantrasyonunu triptik soya agar.
   üzerine 1:10 seri bakteri dilüsyonları kaplayarak doğrulayın not: Bu tahlilde kullanılan bakteri konsantrasyonundaki farklılıklar, sonraki PMN plazma membran geçirgenliği üzerinde büyük bir etkiye sahip olabileceğinden (Şekil 1A), test edilen her bir suşun konsantrasyonunun her deney için belirlenmesi ve suşlar arasında eşdeğer olması esastır.
9. Buz üzerindeki 96 oyuklu plakadaki PMN'lere nazikçe her bir S. aureus suşundan veya RPMI'den (pozitif ve negatif kontroller için) 100 μL / kuyu ekleyin. S. aureus'u kuyucuklara dağıtmak için hafifçe kaya plakası.
10. Plakayı 4 ° C'de 8 dakika boyunca 500 × g'da santrifüjleyerek fagositozu senkronize edin. Santrifüjlemeden hemen sonra plakayı 37 ° C'de inkübe edin (T = 0).
11. İstenilen zamanlarda, plakayı inkübatörden çıkarın ve buzun üzerine yerleştirin. Pozitif kontrol kuyusuna 40 μL% 0.5 Triton X-100 ekleyin.
12. Plakaya yapışan tüm PMN'leri tamamen çıkarmak için numuneleri her bir oyukta yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin, ardından numuneleri 1 μL propidyum iyodür ile 200 μL buz gibi soğuk DPBS içeren buz üzerindeki akış sitometri tüplerine aktarın.
13. Akış sitometrisi kullanarak propidyum iyodür boyama için numuneleri analiz edin.
14. Akış sitometrisi kullanarak propidyum iyodür pozitif PMN'lerin oranını ölçün. DNA'ya bağlandığında, propidyum iyodür 535/617 nm'de uyarılma/emisyona sahiptir.

Sonuçlar

Şekil 1: S. aureus'un fagositozunu takiben PMN'lerin akış sitometrisi analizi. (A) Farklı USA300 veya USA300∆saeR/S konsantrasyonlarının fagositozundan 90 dakika sonra propidyum iyodür pozitif PMN'lerin oranı. (B) Deneyler için kullanılan opsonize S. aureus suşlarının konsantrasyonu panel A'da gösterilmiştir. Veriler, iki kuyruklu t-testi ile belirlendiği gib...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1,5 mL Çıtçıtlı Kapaklı mikro santrifüj tüpleri	VWR (VWR)	89000-044	Hücrelerin yıkanmasında kullanılır
12x75mm Kültür tüpleri	VWR (VWR)	60818-430	Akış sitometri tüpleri olarak kullanılır
50 mL konik santrifüj tüpleri	VWR (VWR)	89039-656	Ortam dağıtmak için
Bacto Triptik Soya Suyu, Soya Fasulyesi-Kazein Sindirim Ortamı	Fischer Bilimsel	211823	Hücre kültürlerini büyütmek için
Parlak Çizgili Hemositometre	Sigma-Aldrich	Z359629	Hücre sayma aparatı
DPBS, 1x (Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin) kalsiyum ve magnezyum ile	Corning	21-030-Özgeçmiş	Hücrelerin yıkanmasında kullanılır
Ficoll-Paque ARTI	GE Sağlık	17-1440-02	PMN arıtma
Fisherbrand Steril Polistiren Tek Kullanımlık Serolojik Pipetler	Fischer Bilimsel	13-678-11E	Sıvıyı aspire etmek için
Greiner CELLSTAR 96 kuyulu plakalar	Kırlangıç Sigma	M0687	Deneysel numuneleri tutmak için plaka
OMICRON Şırınga Filtreleri	Omicron Bilimsel	SFPV13R	Süpernatanları filtrelemek için
Propidyum iyodür	ThermoFisher Bilimsel	P3566 Serisi	Membran geçirimsiz DNA boyası
PYREX Marka 4980 Erlenmeyer Mataraları	Cole-Parmer	EW-34503-24	Hücre kültürlerini büyütmek için
RPMI 1640, L-glutamin içermeyen 1X, fenol kırmızısı	Corning	17-105-Özgeçmiş	Hücreleri askıya almak için kullanılır
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	Membran bütünlüğü pozitif kontrol

Gazetesi Serisi Serisi Gazetesi Serisi