Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Suşlar ve kültür koşulları
Not: Bu çalışmada M. tuberculosis suşu CDC1551 kullanılmıştır, ancak herhangi bir M. tuberculosis suşu aynı şekilde kullanılabilir.
- Bakterileri M-OADC-TW'de (% 0.5 gliserol,% 10 katalaz içermeyen oleik asit dekstroz kompleksi ve% 0.05 Tween-80 ile desteklenmiş 7H9 suyu) 37 ° C'de 0.5 OD600'e (~ 0.2 x 107 koloni oluşturan birim veya CFU) büyütün.
- Kültürü M-OADC-TW (bakteri serileri 1:10 seyreltme) içinde seyreltin. Bakterilerin seyreltmelerini (10,5, 10,6, 10,7, 10,8) CFU'nun belirlenmesine izin vermek için seçici 7H11 plakaları üzerine üç kopya halinde plakalayın.
- Plakaları 37 ° C'de dört hafta boyunca veya koloniler doğru bir şekilde sayılana kadar inkübe edin.
- Bir pelet elde etmek için bakteri aşısını 8,534 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Peleti bir kez 10 mL salin (%0.9 NaCl) ile yıkayın ve peleti 15 mL salin (%0.9 NaCl) içinde tekrar süspanse edin.
2. Madison Odası kullanan farelerin aerosol enfeksiyonu
- Farelerin bir hafta boyunca yeni çevreye alışmasına izin verin.
- Fareleri hazneye yüklemeden önce tartın.
- Anahtarlı uzatma kablosuna üç kablo takın: bu sırayla ana bölme gücü, vakum pompası ve hava kompresörü.
- Cam kavanozu dikkatlice sökün. Cam kavanozu biyogüvenlik kabinine getirin ve akciğerlerde ~ 104 -10 6 CFU bakteri elde etmek için 15 mL salin (%0.9 NaCl) içinde süspanse edilmiş meydan okuma aşısını ekleyin.
- Biyogüvenlik kabinindeki cam kavanozun kapağını kapatın. Kavanozu nebulizatör ünitesine takın ve dikey paslanmaz çelik boruyu, alt (giriş) ucu kavanozdaki sıvı seviyesinin yaklaşık çeyrek inç altında olacak şekilde ayarlayın.
- Deney için gerekli tüm hayvanları (hazne 90 fareye kadar tutabilir) hazneye yükleyin ve kapıdaki tüm mandalları kapatın.
- Ana (oda) hava akış ölçerini kontrol edin. Şamandıranın (topun) merkezinin soldaki ölçekte ölçüldüğü gibi yaklaşık 50 L/dak çalıştığından emin olun.
- Odanın kontrol panelindeki Başlat düğmesine basın. Kompresör hava akış ölçerden (soldaki daha küçük sayaç) geçen hava akış hızını tartıda 4 L/dk olarak ayarlayın. Challenge aşısının nebulize edildiğinden emin olmak için görsel olarak kontrol edin.
- 15 dakika sonra, kontrol panelinin önündeki kırmızı ışık göründüğünde ve sesli bir sinyal koşunun sona erdiğini gösterdiğinde, zamanlayıcıları sıfırlamak için kontrol panelinin sağ alt köşesindeki Sıfırla düğmesine basın.
- Vakumu serbest bırakmak için odanın kapısındaki küçük kırmızı düğmeyi basılı tutun.
- Hazne kapısını açın ve hayvanları çıkarın. Fareleri kafeslerine geri koyun.
- Cam nebulizatör kavanozunu çıkarın ve sızdırmaz, sızdırmaz bir taşıma kabına yerleştirin. Kabı biyo-güvenlik kabininin içine yerleştirin ve meydan okuma süspansiyonunu belirlenmiş bir atık kabına atın.
- Kullanılmış nebulizatör kavanozunu bir biyolojik tehlike torbasının içine yerleştirin ve torbayı otoklava taşınmak üzere kapatın.
- Enfeksiyon prosedürünün sonunda, haznenin içine tamponlu fenol ve% 70 etanol püskürtün ve haznenin 10 dakika oturmasına izin verin.
- Ardından, erişilebilir tüm iç yüzeyleri iyice silin. Kirlenmiş tüm kağıt havluları vb. atın. biyolojik tehlike çöp kutusunda. Çöpleri, atık konteynırlarını ve kullanılmış nebulizatör kavanozlarını otoklavlayın.
- Hayvanları, görüntüleme zaman noktasına kadar muhafaza odasına geri koyun.
- Görüntüleme gününde, hayvanları ikincil bir kapta görüntüleme odasına aktarın.
3. Hayvan anestezisi
- Özelleştirilmiş bir gaz anestezi sistemi kullanarak fareleri izofluran ile uyuşturun.
- Anestezi ünitesinin üstünde bulunan iki kömür filtre kabının her birini tartın.
- Ağırlık ilk ağırlığın 50 g üzerindeyse yeni bir teneke kutu ile değiştirin.
- Prosedür için yeterli izofluran olduğundan emin olmak için buharlaştırıcı üniteyi kontrol edin.
- Burun konisi tutucusunu görüntüleme odasının içine yerleştirin. İşlem için gerekli sayıda burun konisi yerleştirin ve kalan açıklıkları burun konisi blokerleri ile kapatın.
- Yüksek basınç silindirinden gelen oksijen beslemesini açın ve 55 psi'ye ayarlayın.
- Anestezi ünitesinin önünde bulunan tahliye pompasını açın ve 8 L/dk'ya ayarlayın.
- Anestezi ünitesinin önünde bulunan oksijen düğmesini açın.
- Gaz akışını 1,5 L/dk olarak ayarlamak için anestezi indüksiyon odasına giden gaz akışını açın. Gaz akışını kapatın.
- Gaz akışını 0,25 L/dk olarak ayarlamak için görüntüleme odasına giden gaz akışını açın. Gaz akışını kapatın.
- İzofluran buharlaştırıcıyı açın ve% 2 - 2,5'e ayarlayın. İzofluran buharlaştırıcı üzerindeki kadranı çevirerek deney için kullanılan hayvanların sayısına ve ağırlığına göre izofluran seviyesini ayarlayın (~20 g ağırlığındaki bir fare için %2 - 2,5; 300 g ağırlığındaki bir kobay için %4).
- Fareleri anestezi odasına yerleştirin ve kapağı kapatın. Anestezi indüksiyon odasına giden gaz akışını açın.
- Fareleri tamamen anestezi anestezi indüksiyon odasında 5-10 dakika
bekletin.
- Fareler uyuşturulduktan sonra, görüntüleme sırasında onları korumak için gözlere optik bir merhem sürün.
- Görüntüleme prosedürü sırasında farelerin anestezisini kolaylaştırmak için fareleri, burunları burun konisine yerleştirilecek şekilde ventral veya sternal yaslanmaya yerleştirin.
4. Raportör enzim floresan (REF) görüntüleme
- Substratı (20 μM, 2.5 μL / g ağırlık) intraperitoneal enjeksiyon ile enfekte olmuş ve kontrol farelerine enjekte edin. Fareler, görüntüleme odasının içinde 1 dakikadan daha az bir süre anestezi altında kalır.
- Görüntüleme sistemini başlatın.
- Başlat'a tıklayarak sistemi başlatın. Sıcaklık çubuğu yeşile dönene kadar bekleyin.
not: Görüntüleme odası, görüntüleme sırasında hayvanın vücut ısısını korumak için ısıtılmış bir platformdan oluşur.
- Görüntüleme alımı ayarı için Floresan | Tüm hayvan için trans-aydınlatma veya akciğer dokuları için Epi-aydınlatma, Edinme Kontrol Panelinde Yapı ve Kaplama.
- Tek bir fare için Görüş Alanı'nı B'ye ve lamba düzeyini yüksek olarak ayarlayın.
- Pozlama süresini otomatik, orta gruplama, f/stop için 2 - 3 ve uyarma filtresini 745 nm'ye ve emisyon filtrelerini 780 nm ila 840 nm arasında ayarlayın.
- Dizi kurulumu için Dizi Kurulumu'na tıklayın ve akciğer bölgesinde 9 - 12 Trans-aydınlatma noktası seçin.
- Görüntü almak için Al'a tıklayın.
- Görüntüleme sonrası fareyi kafese geri yerleştirin.
- Fareleri tamamen iyileşene kadar izleyin veya deneyin bir zaman noktasında görüntüleme yapıyorsanız CFU'yu ölçmek için onları feda edin. Görüntüleme sonrası farelerin refahını izlemek için değiştirilmiş bir Karnofsky skoru gerçekleştirin.
