Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların (BMM'ler) İzolasyonu ve Farklılaşması
- 0. Gün: 4 - 6 haftalık dişi C57BL / 6 veya BALB / c faresini bir CO2 odasında kurban edin ve servikal çıkık yoluyla ölümü onaylayın. Makas ve forsepsleri %70 etanole batırarak sterilizasyonunu sağlayın. Kemik iliği hücresi izolasyon işlemi boyunca steril kullanım sağlamak için eldivenlere %70 etanol püskürtün.
- Kurban edilen fareyi, ön ayaklarını sabitleyerek ve bol miktarda %70 etanol püskürterek dezenfekte ederek diseksiyon tahtasına sabitleyin.
- Kalça ekleminin yakınında makasla küçük bir kesi (yaklaşık 1 cm) yapın. Altta yatan kası ayırmak ve kalça eklemi etrafındaki cildi kesmek için derinin altına dikkatlice makas sokun.
not: Diseksiyon tahtası, kalça eklemine daha iyi erişim sağlamak için döndürülebilir.
- Ayak bileğine doğru çekerek ve çıkararak bacaktaki cildi dikkatlice çıkarın. Ayak bileğinden ayağı kesin, kaval kemiğini tamamen sağlam bırakmak için ayak bileği ekleminden veya altından kesmeye çok dikkat edin.
not: Bu aşamada fibula gevşek bir şekilde tutturulur ve forseps ile kolayca ayrılabilir.
- Dönme noktasını belirlemek için uyluk kemiğini manipüle ederek kalça eklemini manuel olarak bulun. Femurun proksimal başını sağlam bırakmak için kalça ekleminin üzerindeki bacağı kesmek için dikkatlice makas kullanın.
- Makasla bacağından mümkün olduğunca fazla kas ve bağ dokusu çıkarın. Ayak bileğinde kalan deriyi ve kalça ekleminin üzerindeki fazla kemik malzemesini çıkarın.
- Temizlenmiş bacak kemiklerini, buz üzerinde bir Petri kabına penisilin / streptomisin (% 1 nihai konsantrasyon) ile desteklenmiş steril Roswell Park Memorial Institute RPMI'ye yerleştirin.
- Tibia ve uyluk kemiğini diğer arka bacaktan izole etmek için 1.4'ten 1.6'ya kadar olan adımları tekrarlayın.
- Sterilize edilmiş forseps ve steril #10 bıçak kullanarak RPMI'ye batırılmış kemiklerden kalan kas ve bağ dokusunu çıkarın.
- Kemikleri Petri kabı kapağına yerleştirin. İliğe erişmek için kaval kemiğini bıçak ayak bileği ekleminin hemen üzerinde olacak şekilde dikkatlice kesin. Diz ekleminin hemen altından keserek tibiayı bacağın geri kalanından çıkarın.
- Penisilin / streptomisin (% 1 nihai konsantrasyon) ile desteklenmiş 10 mL steril RPMI'yi 10 mL'lik bir şırıngaya çekin ve 25G'lik bir iğne takın.
- Kaval kemiğini forseps ile buz üzerinde 50 mL'lik konik bir tüp üzerinde dikey olarak sıkıca tutun. Kemik iliğini diğer uçtan konik tüpe akıtmak için kemiğin ucuna yaklaşık 5 mL RPMI'yi nazikçe enjekte etmek için şırıngayı kullanın. Kemik beyazlaşana kadar kemik iliğini toplam 10 mL RPMI ile yıkayın.
not: İyice yıkandıktan sonra kemik beyaza dönmelidir. Değilse, iliği çıkarmak için yıkamaya devam edin. Tibianın distal ucunun, iğneyi yerleştirmek için çok dar olması durumunda bıçakla geriye doğru kesilmesi gerekebilir.
- Kemik kemiğinin her iki ucunu da kemik iliğine erişmek için ortaya çıkarmak için uyluk kemiğini diz ekleminin hemen üstünden ve kalça ekleminin hemen altından kesin. Kemik iliğini femurdan tibia ile aynı şekilde toplam 10 mL RPMI ile yıkayın.
- Kalan kemiklerle 1.6'dan 1.13'e kadar olan temizleme ve yıkama adımlarını tekrarlayın ve kemik iliği ile yıkanmış hücreleri tek bir 50 mL konik tüpte toplayın
not: Kemik yıkamadan önce diseksiyon sırasında herhangi bir noktada bir kemik kırılırsa, bu kemikten alınan iliği kullanmayın.
- Dört kemikten yıkanan kemik iliğini toplamak için kullanılan konik tüpü 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
- 60 mL steril BMM ortamı (% 20 fetal sığır serumu,% 1 FBS,% 1 penisilin / streptomisin, 1.2 mM Na-piruvat, 25 μg / mL insan Makrofaj Koloni Uyarıcı Faktör (M-CSF) nihai konsantrasyonu ile RPMI) 175cm2'lik bir filtre kapaklı hücre kültürü şişesine yerleştirin.
- Santrifüjlemeden sonra süpernatanı atın ve şişeden 5 mL BMM ortamı kullanarak nazikçe yukarı ve aşağı pipetleme yaparak hücre peletini yeniden süspanse edin.
- Hücre süspansiyonunu kültür şişesine aktarın ve maksimum hücre geri kazanımını sağlamak için konik tüpü kültür şişesinden BMM ortamı ile iki kez durulayın. Hücre süspansiyonunun bir ortama iyice karıştırıldığından emin olun ve ilk 175cm2 hücre kültürü şişesinden 30 mL'yi bir filtre kapaklı ikinci bir 175 cm2 hücre kültürü şişesine dağıtın.
- Kirletici fibroblastların, yerleşik makrofajların ve diğer yapışkan hücrelerin ayrılmasına izin vermek için her gece 30 ° C'de,% 5 karbondioksit (CO2) 37 mL hücre süspansiyonu içeren her iki şişeyi de inkübe edin.
- 1. GÜN: Farklılaşmamış kemik iliği hücreleri içeren süpernatanı şişelerden yaklaşık 10 mL / tabakta 100 mm x 15 mm TC ile muamele edilmemiş polistiren Petri kaplarına aktarın ve 37 ° C,% 5 CO2'de inkübe edin.Şişeleri atın.
- 3. veya 4. GÜN: Her Petri kabına ek olarak 5 mL BMM ortamı (önceden 37 ° C'ye ısıtılmış) ekleyin ve inkübasyona 37 ° C,% 5 CO2'de devam edin.
2. BMM'lerin Enfeksiyon için Lameller Üzerine Kaplanması (GÜN 7 veya 8)
- Her boş kuyucuğun dibine dört (4) adet steril 12 mm cam lamel (otoklavlanmış ve kapalı bir cam kapta saklanmış) yerleştirerek 6 oyuklu doku kültürü plakaları hazırlayın.
not: Her bir steril 12 mm'lik lamel içini, bir vakum hattına takılan bir aspirasyon ucu ile alın. Lamelleri üst üste binmeden kuyucuklara yerleştirin ve vakumu kesmek için boruyu sıkıştırarak istenen konumda serbest bırakın.
- Yapışık kemik iliği türevi makrofajlarla kaplanmış Petri kaplarından aspire ortamını (ve yapışık olmayan hücreleri) aspire edin ve yapışık hücreleri 2x, önceden 37 °C'ye ısıtılmış kalsiyum ve magnezyum klorür (PBS -/-) içermeyen steril Dulbecco'nun Fosfat tamponlu salin ile nazikçe durulayın.
- Her bir Petri kabına damla damla, 5 mL steril 1x PBS -/- nihai konsantrasyon 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ekleyin ve yapışan BMM'leri ayırmak için 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Mikroskop kullanarak hücrelerin ayrıldığını doğrulayın.
- 50 mL'lik bir konik tüpte 1 mM EDTA ile desteklenmiş 1x PBS'de asılı tüm ayrılmış hücreleri toplayın. Her kabı 2 kez 5 mL PBS -/- ile durulayın ve hücre süspansiyon havuzuna ekleyin.
not: Hücre süspansiyonu, toplama işlemi sırasında makrofajları EDTA toksisitesinden korumak için ek PBS -/- ile seyreltilebilir.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve makrofajları pipetleme ile 5 - 10 mL BMM ortamında yeniden süspanse edin. Tüplere yapışmasını ve topaklanmasını önlemek için yeniden askıya alınmış hücreleri buzun üzerine yerleştirin.
- Hemositometrede Tripan mavisi dışlamasını kullanarak canlı hücreleri sayın.
not: 5 mL ortamda yeniden süspanse edilen BMM hücrelerini saymak için, 445 μL PBS -/- ve 30 μL% 0.4 Tripan mavisi çözeltisinde 25 μL hücre süspansiyonunun bir seyreltme karışımı tipik olarak bir hemositometrede kolay miktar tayinine izin verir (son hesaplama için 20x seyreltme faktörü dikkate alınarak). Yalnızca Tripan mavisi (canlı hücreler) ile lekelenmemiş hücreleri sayın. Bu karışım çok konsantre veya seyreltilmişse hücre süspansiyonunun hacmi değişebilir. Genel olarak, preparat başına BMM verimi, tek bir fareden 2 x 107 ve 5 x 107 hücre arasında değişir.
- Hücre süspansiyonunu BMM ortamında istenen kaplama konsantrasyonunda (5 x 105 / mL) hazırlayın ve süspansiyonu her bir kuyucuk 1 x 106 makrofaj alacak şekilde oyuk başına 2 mL ortamda 6 oyuklu plakaya dağıtın.
not: Bu, her kuyucuğun lamelleri düzgün bir şekilde kaplamak için yeterli sayıda makrofaj almasını sağlayan kritik bir adımdır. Kuyucuklardaki lamellerin üst üste binmediğini veya ortamda yüzmediğini kontrol edin. Eğer öyleyse, steril bir pipet ucuyla nazikçe ayarlayın.
- Gece boyunca 37 °C, %5 CO2'de inkübe edin.
3. Leishmania amazonensis'in Enfektif Formlarının Saflaştırılması
NOT: Leishmania'yı enfeksiyonlar için hazırlayın - metasiklik promastigotları sabit promastigot kültürlerinden saflaştırın veya kültürdeki promastigotları standart L. amazonensis aksenik farklılaşma protokolünü kullanarak amastigot formuna farklılaştırın.
- Leishmania metasiklik promastigotlarının yoğunluk gradyanlı ortam kullanılarak saflaştırılması (Malzemeler)
- Steril, endotoksin içermeyen suda% 40 yoğunluk gradyan ortamı stok çözeltisi hazırlayın.
- M199 ortamında% 10 konsantrasyon hazırlamak için yoğunluk gradyan çözeltisini 10x M199 ortamında (serumsuz) seyreltin.
- Tüm çözeltileri 0,22 μm'lik bir filtreden geçirin.
not: Stok çözeltileri 4 ° C'dekaranlıkta 1 aydan fazla saklanamaz.
- 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpünün altına 2 mL %40 yoğunluk gradyan ortam çözeltisi ekleyin.
- M199'da %2 yoğunluk gradyan medya çözeltisinin 2 mL'lik %40 yoğunluklu gradyan medya çözeltisini, iki katman arasında herhangi bir karışımı önlemek için bir Pasteur pipeti kullanarak dikkatli bir şekilde yerleştirin.
- 10 dakika boyunca 1.900 x g'da santrifüjleme ile sabit faz kültüründen 1 x10 9 parazit toplayın.
- 6 mL Dulbecco'nun Modifiye Esansiyel Ortamında (DMEM) hücreleri yeniden askıya alın.
- Hücre süspansiyonunun 2 mL'lik katmanı, katmanlar arasında karışmayı önlemek için bir Pasteur pipeti kullanarak nazikçe% 10 yoğunluklu gradyan ortam katmanının üzerine.
- Degradeyi oda sıcaklığında 1.300 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.
not: Leishmania türleri arasındaki fiziksel özelliklerdeki farklılıklar nedeniyle, maksimum verimi sağlamak için her biri için santrifüjleme koşullarının biraz ayarlanması gerekebilir.
- Üst %10 yoğunluk gradyan ortam sınırında (%0 ve %10 yoğunluklu gradyan ortam katmanları arasındaki arayüz) oluşan banttan parazitleri (metasiklik promastigot formunda zenginleştirilmiş) toplayın.
- Parazitleri bir hacim DMEM ile seyreltin ve santrifüjleme ile toplayın (oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1.900 x g).
- 500 μL DMEM ortamında yeniden süspanse edin ve verimi ölçmek için bir hemositometrede sayın.
- Aksenik kültür koşulları altında (düşük pH / yüksek sıcaklık) L. amazonensis amastigotes üretimi
- 5 mL log fazlı promastigot kültürünü (26 oC'de pH 7.4) eşit hacimde amastigot ortamı (pH 4.5) ile 25 cm2 şişe (toplam 10 mL ortam) kullanarak karıştırın ve gece boyunca 26 ° C'de inkübe edin.
- Şişeyi 26 °C'den 32 °C'ye kaydırın.
- 3 veya 4 gün sonra, kültürü 32 ° C'de amastigot ortamında 1: 5 oranında bölün.
- Enfeksiyonlarda kullanıma hazır olup olmadıklarını görmek için önümüzdeki 3 - 4 gün içinde (en fazla 7 gün) parazitleri kontrol edin.
not: Sağlıklı aksenik amastigotlar, görünür kamçı olmadan oval bir şekle sahip olmalıdır. Kısmen farklılaşmış amastigotlar, kısa kamçılı geniş oval bir şekle sahiptir. Kültürde çok fazla küme olmamalıdır - birçok küme, büyümeyen, ölmekte olan parazitlerin bir göstergesidir. Amastigot kültürü 1:5 oranında bölünebilir ve en fazla 3 hafta boyunca korunabilir.
4. L. amazonensis enfeksiyonu
- Parazit süspansiyonlarını istenen enfeksiyon çokluğuna (MOI) göre seyreltin (genellikle makrofaj başına 3-5 metasiklik promastigot [1:3 veya 1:5 MOI] ve makrofaj başına 1 amastigot [MOI 1:1]). Halihazırda 2 mL ortam içeren her bir oyuğa 50 - 100 μL'lik bir hacimde PBS -/- içinde Leishmania ekleyin.
- Enfeksiyon için BMM'leri amastigotlarla 1 saat ve metasiklik promastigotlarla 3 saat 34 oC'de inkübe edin.
not: Optimal enfeksiyon sıcaklığı türlere göre değişebilir.
- İnkübasyonun ardından, her bir kuyucuktaki serbest parazitleri 3x 2 mL PBS ile iyice yıkayın -/- 37 ° C'ye önceden ısıtılmış
not: Lamellerin birbiri üzerinde yüzmemesini sağlamak için PBS'yi nazikçe dağıtın. Plakayı yavaşça döndürün ve ardından sıvıyı aspire edin. Çapraz kontaminasyonu önlemek için birden fazla parazit türü kullanıyorsanız ayrı bir aspirasyon ucu kullanın.
- Her bir kuyucuğu PBS'de -/- 1.5 - 2 mL% 2 PFA ile 10 dakika inkübe ederek 1 saat veya 3 saat zaman noktası örneklerini sabitleyin. 3x'i PBS -/- ile yıkayın. Son yıkamayı aspire etmeyin ve lamel içeren lamelleri PBS'de lekelenene kadar soğutmayın.
- Daha fazla zaman noktası için plakalardaki her bir oyuğa 2 mL taze BMM ortamı ekleyin ve 34 ° C'de inkübe edin.
- Kalan zaman noktalarını adım 4.3'te açıklandığı gibi istediğiniz gibi sabitleyin ve plakaları lekelenene kadar soğutun.
>5. 4",6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) Boyama ve Lamel Montajı
- Lamel içeren kuyucuklardan PBS'yi aspire edin ve% 0,1 iyonik olmayan deterjan ile 1,5 mL PBS -/- ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin, ardından 2 mL PBS -/- ile 3 kez yıkayın.
- Lamel içeren kuyucuklara 2 μg/mL DAPI (suda 5 mg/mL stok çözeltisinden seyreltilmiş) ile 1 mL PBS -/- ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat daha inkübe edin.
not: DAPI ile inkübasyon süresi, hücre içi Leishmania parazitlerinin uygun şekilde görselleştirilmesi için kritik öneme sahiptir. Makrofaj çekirdekleri, daha büyük boyutları ve deoksiribonükleik asit (DNA) içeriği nedeniyle hızla boyanır, ancak hücre içi parazitlerin çekirdeklerinin boyanması daha yavaştır. Bu nedenle, inkübasyon süresinin BMM çekirdeklerini görselleştirmek için gerekenin ötesine uzatılması, DAPI'nin parazit plazma zarı ve parazit çekirdek zarından geçmesine izin vermek için gereklidir. Uygun DAPI boyası ile, nükleer DNA'ya ek olarak, parazitin kamçı cebine yakın mitokondriyal kinetoplast DNA'sı da görselleştirilebilir.
- Lamelleri 3x içeren her bir kuyucuğu 2 mL PBS -/- ile yıkayın ve ardından hücre tarafını aşağı yerleştirmek için lamelleri forseps ile kaldırın ve çevirin ve ticari olarak temin edilebilen bir antifade montaj reaktifi ile cam mikroskop slaytlarına monte edin.
not: Lameller son derece kırılgandır ve dikkatli kullanım gerektirir. Kaldırırken, özellikle kuyuların yan duvarına karşı üzerlerine baskı uygulamaktan kaçının. Birkaç damla PBS eklemek -/- lamel ile kuyu arasındaki yüzey gerilimini azaltır ve kaldırma işlemini kolaylaştırır. Lamelleri kuyunun dibinden kaldırmaya yardımcı olmak için ince bir iğne kullanılabilir. Kızağa bir lamel yerleştirdikten sonra, montaj ortamındaki hava kabarcıklarını dışarı itmek için forseps ile hafifçe bastırın. Kaldırma işlemi sırasında bir lamel kırılmışsa veya muhtemelen ters dönmüşse, yeniden monte etmeyin; Sadece yedek dördüncü lamel kullanın.
- Slaytları nicelleştirmeye kadar soğutun.
6. Enfeksiyon Ölçümü
- Daldırma yağı (358 nm'de uyarma; 461 nm'de optimum emisyon) içeren 100X objektif lens kullanarak makrofajlara odaklanarak DAPI lekeli slaytları floresan mikroskobu altında inceleyin.
Odağın cam slayt ve lamel arasındaki makrofaj tabakası üzerinde olduğundan emin olun.
- Her bir görüş alanı için makrofajların sayısını (DAPI ile boyanmış büyük çekirdekler) ve her bir makrofaj çekirdeğinin etrafında kümelenmiş daha küçük amastigot çekirdeklerinin sayısını (bkz. Şekil 1A, DAPI) manuel bir sayaç kullanarak ölçün.
not: Amastigot çekirdeklerinin tümü, küçük boyutları nedeniyle tek bir odak düzleminde görünmeyebilir. Makrofaj çekirdeklerine odaklanıldığında görünür olanları sayın ve ardından makrofaj çekirdeklerinin üstündeki ve altındaki düzlemlerde parazit çekirdeklerini kontrol etmek için ince odak kullanın.
- Nicelemeyi tekrarlamak için başka bir görüş alanına geçin. Sayılan alan sayısını izlemek için ayrı bir sayaç tuşu kullanın. Sayım çakışmasını önlemek için her bir lamel boyunca paralel sıralar halinde görsel alanlar arasında hareket edin.
- Lamel başına en az 200 makrofaj miktarını belirleyin. Enfeksiyonun her bir zaman noktasını üç nüsha halinde ölçün (3 lamel kağıdı). Lamel üst üste binmesi, kötü montaj, cam kırılması vb. nedeniyle öncekilerden biri saymaya uygun değilse dördüncü lameli sayın.
not: Herhangi bir lamel üzerinde 200 makrofaj sayılamıyorsa, yedek dördüncüyü sayın.
- Enfeksiyon oranlarını amastigotlar/makrofaj veya amastigotlar/100 makrofajlar olarak hesaplayın ve ham kantitasyon verilerinden enfekte makrofajların yüzdesini belirleyin.
