$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Organoid Kültürlerin Geçişi
- Kuyudaki bodrum matrisine 1 ml soğuk bazal ortam ekleyin. 1 ml'lik bir mikropipet kullanarak, bodrum matrisi parçalanana kadar kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyin. 15 ml'lik bir tüpe aktarın. Buzun üzerine yerleştirin.
- Pipetteki organoidleri alın ve 10 kat yukarı ve aşağı kuvvetlice pipetleyin. Organoidlerin kırılması gözle görülebilir.
2. Organoid Kültürün Mikroenjeksiyonu.
Not: Bu protokol, bakterileri organoidlere mikroenjekte etmek için kullanılabilir. Enjeksiyona mikroenjeksiyona daha izin veren organoidlerle başlamak faydalı olabilir. Örneğin, fare mide organoidleri, hedeflenmesi kolay olan çok büyük kistik organoidlere dönüşebilir.
- Malzemenin Hazırlanması
- Üreticinin tavsiyelerine göre, bir mikropipet çektirmesi kullanarak bir cam kılcal damarı iki enjeksiyon iğnesine çekin. Mikropipet çektirmesi, cam kılcal damarı ortada ısıtacak ve kılcal damarı iki parçaya çekerek iki cam iğne oluşturacaktır. Birkaç iğne çekmek ve bunları temiz bir petri kabında saklamak pratiktir.
- Bakteriyel enfeksiyona izin vermek için, antibiyotikleri en az 3 orta değişiklik (= bir hafta) boyunca tüm ortamlardan çıkarın. Bu, antibiyotikleri bodrum matrisinden seyreltecektir. Belirli bir antibiyotiğe dirençli bir bakteri türü kullanılıyorsa, kontaminasyon olasılığını en aza indirmek için bu özel antibiyotiği ekleyin.
- Tezgahı mikroenjeksiyonlar için hazırlayın. Farklı biyogüvenlik seviyelerinde çalışmak için, steril bir tezgahın içine stereomikroskop yerleştirmek gerekebilir. Bu protokolde, H. pylori biyogüvenlik seviye 2 koşulları altında steril bir tezgah içinde stereomikroskop altında enjekte edilir.
- Bakterileri standart protokollere göre kültürleyin.
- Enfeksiyonun çokluğunu (MOI) tahmin etmek için iki parametreyi tahmin edin: Aşağıda belirtildiği gibi bakteri sayısı ve organoid başına hücre sayısı. MOI, sonuçlarla, örneğin konakçının IL-8 mRNA ekspresyonu ile ilişkilendirilebilir.
- Enfeksiyon çözeltisindeki bakteri yoğunluğunu hesaplamak için, önce standart protokollere göre optik yoğunluk ve koloni oluşturan birimlerin (CFU) standart eğrisini oluşturun. 550 nm'de 0,1'lik bir optik yoğunluk yaklaşık 107 CFU/ml vermelidir.
- Organoid başına hücre sayısını tahmin etmek için, 1 kuyucuktaki organoid sayısını sayın. Adım 1.1-1.4'te belirtildiği gibi organoidleri bozun. 200 x g ve 4 ° C'de 5 dakika santrifüjledikten sonra, 1 ml enzimatik ayrışma çözeltisi ekleyin ve yeniden süspanse edin.
- 37 ° C'de 5-10 dakika boyunca tekrarlanan çalkalanarak inkübe edin. Hücrelerin mikroskop altında tek hücrelere ayrılıp ayrılmadığını belirleyin (10X büyütmede Leica DMIL gibi ters çevrilmiş mikroskop). Gerekirse, inkübasyonu uzatın.
- Bir hemositometre kullanarak organoid başına hücre sayın ve organoid başına hücre sayısını hesaplayın. Yaklaşık 200 μm çapında insan mide organoidleri yaklaşık 4.000 hücreye sahiptir. 0.2 μl'lik bir bakteri çözeltisinin ml başına 1 x 109 bakteri ile enjeksiyonu, yaklaşık 50'lik bir MOI ile sonuçlanır.
- Organoidlerin enjeksiyonu.
Not: Mikroenjeksiyon için cam iğne, bir mikromanipülatör tarafından 3 boyutta manevra yapılabilen bir tutucu içinde stabilize edilir. Organoidler kuyu içindeki bodrum matrisi içinde kalır. Kuyudaki boyut ve konumlandırma nedeniyle, tüm organoidler enjeksiyona eşit derecede uygun değildir. Genellikle, bir kuyucuktaki en büyük 30 organoid 5 dakika içinde hedeflenebilir.
- Bakterileri toplayın ve standart protokollere göre bazal ortamda yıkayın.
- Optik yoğunluğa göre ml başına bakteri sayısını hesaplayın (bkz. adım 2.1.5.1). Bakterileri bazal bir ortamda ml başına 1 x 109 bakteriye seyreltin.
- Bir cam iğne alın. Forseps kullanarak, ucu açıklığın yaklaşık 10 μm genişliğinde olacağı şekilde kırın.
- İğneyi enjeksiyon tutucusuna yerleştirin ve mikromanipülatöre sabitleyin.
- İğnenin içine yaklaşık 10 μl bakteri solüsyonu alın.
- Stereomikroskop altına organoid kültürler içeren düşük kenarlı 4 oyuklu bir plaka yerleştirin.
- Mikromanipülatör ile gezinirken, iğne ile tek bir organoidi hedefleyin. İğneyi organoide yakın konumlandırın ve ardından iğneyi tek bir hızlı hareketle organoidin içine yerleştirin. Mikroenjektörü kullanarak her bir organoide yaklaşık 0.2 μl bakteri çözeltisi enjekte edin.
3. Herhangi bir analiz için organoidleri hasat edin.
- Örneğin, organoidleri 4 saat sonra sabitleyin. Süpernatanı çıkarın ve 1 ml %2 formaldehit ekleyin ve 4 ° C'de RT veya O/N'de 20 dakika inkübe edin. Organoidler, standart prosedürlere göre immünohistokimya için işlenebilir.