1. Yeşil floresan protein, GFP etiketli Coxiella transpozon mutantları kütüphanesinin oluşturulması
Coxiella burnetii RSA439 NMII'yi yerel kurallara uygun bir mikrobiyal güvenlik kabininde (MSC) biyogüvenlik muhafaza seviyesi 2'de (BSL-2) manipüle edin. Kullanılan bakteri modeliyle uyumluysa, klonal mutantlar elde etme olasılığını artırmak için 1.4.1'den 1.4.4'e kadar olan adımları tekrarlayın. Tipik bir mutant kütüphanesi (en azından), kullanılan organizmanın genomunda açıklanan kodlama dizilerinin sayısının üç katına eşit olan bir dizi mutanttan oluşur.
- Elektroyetkin Coxiella RSA439 NMII'nin hazırlanması:
- 1x asitlenmiş sitrat sistein ortamı-2 (ACCM-2) hazırlayın: 13.4 mM sitrik asit, 16.1 mM sodyum sitrat, 3.67 mM potasyum fosfat, 1 mM magnezyum klorür, 0.02 mM kalsiyum klorür, 0.01 mM demir sülfat, 125.4 mM sodyum klorür, 1.5 mM L-sistein, 0.1 g/L Bacto Neopeptone, 2.5 g/L kasamino asitler, 1 g/L metil beta siklodekstrin, 125 ml/L Roswell Park Memorial Institute (RPMI). PH'ı 4.75'e ayarlayın ve filtreyle sterilize edin (otoklav yapmayın).
not: Sıvı ACCM-2, yaklaşık 1 ay boyunca 4 ° C'de stabildir.
- -80 °C stoklarından 100 ml ACCM-2'yi 2 x 106 genom eşdeğeri (GE)/ml Coxiella RSA439 NMII (daha önce üretilen ve adım 1.5'te olduğu gibi miktarı belirlenmiş bir bakteri stoğundan) ile aşılayın ve bakteriyel süspansiyonu havalandırmalı kapaklı 75 cm'lik2 hücre kültürü şişelerine dağıtın (şişe başına 10 - 15 ml bakteri süspansiyonu). %5 karbondioksit (CO2) ve% 2.5 oksijen (O2) içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C'de 7 gün boyunca büyüyün.
- Elde edilen bakteri süspansiyonunu 50 ml'lik tüplerde toplayın ve 4 ° C'de 1 saat boyunca 3.900 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve peleti 30 ml% 10 gliserol içinde yeniden süspanse edin. 4 ° C'de 1 saat boyunca 3.900 x g'da santrifüjleyin.
- Peletleri yeterli hacimde% 10 gliserol (tipik olarak 2 ml) ve 500 μl'lik tüplerde 50 μl alikot olarak yeniden süspanse edin. Tüm süreç boyunca yeniden süspanse edilmiş bakterileri buz üzerinde tutun.
not: Bu aşamada, bakteriler elektroyatiftir ve bir elektroporasyon gerçekleştirmek için bir alikot yeterlidir. Bakteriyel süspansiyonlar -80 °C'de 6 ay saklanabilir veya doğrudan plazmid deoksiribonükleik asidin (DNA) elektroporasyonu için kullanılabilir.
- Yetkin Coxiella'nın transpozon ve transpozaz kodlayan plazmitlerle elektroporasyonu:
- 0,1 cm'lik bir elektroporasyon küvetini buz üzerinde 10 dakika önceden soğutun. 50 μl elektroyetkin Coxiella'yı 10 μg transpozon plazmidi ve 10 μg transpozaz plazmidi ile karıştırın. Gliserolün seyreltilmesini en aza indirmek için plazmit konsantrasyonunun 500 μg/ml'den yüksek olduğundan emin olun.
- Aşağıdaki kurulumu kullanarak elektrostatik yapın: 18 kV, 500 Ω, 25 μF. Elde edilen zaman sabitinin 9 ile 13 msn arasında olduğundan emin olun.
- Hemen 950 μl rpmi ekleyin, elektroporasyonlu bakterileri yeniden süspanse edin ve vidalı kapaklı bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında tutun.
- 200 μl elektropore bakteri alın ve% 1 ısıyla inaktive edilmiş Fetal Sığır Serumu (FBS) ile takviye edilmiş 3 ml ACCM-2'yi 6 oyuklu plakalara ekleyin. Kalan elektropore bakteri hacmine 88 μl dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin (% 10 DMSO'luk bir nihai konsantrasyona ulaşmak için) ve -80 ° C'de saklayın.
NOT: Aşağıdaki protokol için, transpoze edilebilir element ve transpozaz iki farklı plazmit tarafından kodlanmıştır (sırasıyla pITR-CAT-GFP ve pUC19-Himar1C9). Her iki plazmit de Coxiella'ya özgü bir replikasyon kökeninden yoksundur, bu da onları Coxiella'da elektropore edildiğinde intihar plazmitleri yapar. Bu, stabil transpozon yerleştirmeleri sağlar. Transpoze edilebilir eleman, seçim için Coxiella promotörü p1169'un düzenlemesi altında bir Kloramfenikol direnç kaseti ve üretilen mutantları GFP ile etiketlemek için Coxiella promotörü p311'in düzenlemesi altında gfp geni içerir.
- Transpozon mutantlarının seçimi:
- Yukarıda tarif edildiği gibi (1.2.4) aşılanmış 6 oyuklu plakaları, gece boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 ve% 2.5 O2 nemlendirilmiş bir atmosferde inkübe edin. Uygun antibiyotikleri ekleyin (375 μg/ml kanamisin veya 3 μg/ml kloramfenikol). Bakteri kültürünü yukarıda açıklanan koşullarda 3 gün daha inkübe edin.
- Bireysel mutantların izolasyonu:
- Katı ACCM-2 plakalarının hazırlanması ve Coxiella transpozon mutantlarının kaplanması
not: Aşağıdaki talimatlar 1 Petri kabı içindir, koloni izolasyonu için en uygun aşılama hacmini değerlendirmek için birkaç bakteri kültürü seyreltmesinin test edilmesi gerekir.
- 10.5 ml% 0.5 agarozu bir mikrodalgada ısıtın ve 55 ° C'lik bir su banyosunda soğumaya bırakın. 37 ° C'de 11.25 ml 2x ACCM-2 (pH 4.75) ısıtın.
- Alt agarozu hazırlayın:
- 10 ml erimiş %0.5 agarozu 10 ml 2x ACCM-2 ile karıştırın ve uygun antibiyotikleri (375 μg/ml kanamisin veya 3 μg/ml kloramfenikol) ekleyin.
- Hemen Petri kabına dökün. Petri kabını kapaksız tutun, ortamı 30 dakika soğumaya bırakın ve 20 dakika havayla kurutun.
- Üst agarozu hazırlayın:
- 1.25 ml 2x ACCM-2'yi 5 ml'lik bir polistiren tüpte 0.75 ml su ile karıştırın, uygun antibiyotikleri (375 μg/ml kanamisin veya 3 μg/ml kloramfenikol) ekleyin ve 37 °C'de inkübe edin.
- Bakteri kültürünü (tipik olarak 1 ila 100 μl) ekleyin ve 5 saniye boyunca girdap yapın.
- 0.5 ml eritilmiş agaroz ekleyin, karıştırın ve hemen alt agarozun üzerine dökün.
- 20 dakika soğumaya bırakın, Petri kabının kapağını kapatın ve agaroz katılaşmasını kolaylaştırmak için 4 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
- Bir MSC'de kapaksız olarak 20 dakika havayla kurutun. Plakaları 37 ° C'de% 5 CO 2 ve% 2.5 O2 nemlendirilmiş bir atmosferde 6 ila 7 gün boyunca büyütün.
- % 10 DMSO'luk bir nihai konsantrasyona ulaşmak ve -80 ° C'de saklamak için kalan bakteri kültürlerine DMSO ekleyin.
- Optimum seyreltmeyi aşağıdaki gibi değerlendirin: çapraz kontaminasyonu önlemek için kolonilerin 0,5 ila 1 mm çapında olduğundan ve uygun şekilde izole edildiğinden emin olun. Kalan bakteri kültürlerini 1.4.2 noktasından çözün ve 1.4.1.2 ve 1.4.1.3'te tarif edildiği gibi ACCM-2 agar üzerinde uygun seyreltmede plakalayın. 1.4.1.3.5'te açıklandığı gibi 6 ila 7 gün kuluçkaya yatırın.
- Koloniler tespit edilebilir hale geldikten sonra, 1 ml'lik bir ucun ucunu keserek, izole edilmiş kolonileri içeren tıkacı seçerek ve uygun antibiyotikleri (375 μg/ml kanamisin veya 3 μg/ml kloramfenikol) içeren 1.5 ml ACCM-2'de pipetleyerek koloniyi dağıtarak toplayın. 1.3.1'de açıklanan koşullarda tek tek kolonileri 6 gün boyunca büyütün. İnkübasyonun 3. gününde, her bir kültürü pipetleyerek bakteri kümelerini dağıtın.
- Her mutant süspansiyonu -80 °C'de %10 DMSO'da 96 oyuklu plakalarda 2D barkodlu vidalı kapaklı tüplerde saklayın.
- Bakteri konsantrasyonunun değerlendirilmesi:
not: Aksenik bir ortamda çoğalan bakteri mutantlarının büyüme eğrilerini elde etmek için aşağıdaki protokol uygulanabilir (bkz. 1.4.4).
- Standart eğri hazırlığı:
- 1x Tris-etilendiamintetraasetik asit, EDTA (TE) içinde 2 μg/ml'lik bir çift sarmallı DNA (dsDNA) (tipik olarak bilinen boyut ve konsantrasyona sahip rastgele bir plazmit) stok çözeltisi hazırlayın. 2 μg/ml ila 2 ng/ml arasında değişen konsantrasyonlar elde etmek için stok çözeltisinden 10 kat seri seyreltme hazırlayın. Her konsantrasyondan 50 μl'yi, siyah duvarlı ve alt kısmı olan 96 oyuklu bir mikroplakanın tek kuyucuklarına dağıtın (bkz. Malzemeler).
- DsDNA kantitasyon reaktifini 1x TE tamponunda 1:200 oranında seyreltin ve 96 oyuklu mikroplakadaki her numuneye 55 μl seyreltilmiş reaktif ekleyin. Bir plaka çalkalayıcı kullanarak iyice karıştırın ve karanlıkta oda sıcaklığında 2 ila 5 dakika inkübe edin.
- Bir floresan mikroplaka okuyucu ve standart floresein dalga boyları (uyarma ~ 480 nm, emisyon ~ 520 nm) için filtreler kullanarak numunelerin floresansını ölçün.
- Plazmit konsantrasyon aralığını floresan yoğunluğu okumalarına göre çizin.
- Bakteriyel süspansiyon miktarı:
- Siyah duvarlı ve tabanlı 96 oyuklu bir mikroplakada oyuk başına 5 μl% 10 Triton X-100 dağıtın (bkz. Malzeme Tablosu). Her oyuğa 50 μl bakteri süspansiyonu ekleyin ve bir plaka çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
- DsDNA kantitasyon reaktifini 1x TE tamponunda 1:200 oranında seyreltin ve 96 oyuklu mikroplakadaki her numuneye 55 μl seyreltilmiş reaktif ekleyin. Bir plaka çalkalayıcı kullanarak iyice karıştırın ve karanlıkta oda sıcaklığında 2 ila 5 dakika inkübe edin.
- Bir floresan mikroplaka okuyucu ve standart floresein dalga boyları (uyarma ~ 480 nm, emisyon ~ 520 nm) için filtreler kullanarak numunelerin floresansını ölçün.
- Bakteriyel DNA konsantrasyonunu elde etmek için, 1.5.1.4 noktasında elde edilen çizelgede floresan okumalarını çizin. Bakteri konsantrasyonları elde etmek için DNA konsantrasyonunu Coxiella genomunun kütlesine (2.2 fg) bölün. Sonuçları Genom Eşdeğeri/ml cinsinden ifade edin.
- ACCM-2'de önemli bir büyüme kusuru sergileyen mutantları atın.
>2. Tek Primer Koloni Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR), Sıralama ve Açıklama
>NOT: Aşağıdaki protokol 96 örneğin DNA amplifikasyonu içindir, aşağıdaki adımlar için çok kanallı bir pipet önerilir. Manyetik boncuklar ve transpozona özgü bir primer (2.3) ile DNA dizilimi kullanılarak PCR ürünlerinin kolon saflaştırılması, harici bir şirkete taşeronluk yapılır.
- Amplifikasyon primerinin, Coxiella genomundaki transpozon yerleştirme bölgesini kapsayan PCR ürünlerini elde etmek için ters tandem tekrarının (ITR) yukarı akışında 100 ila 200 baz çifti arasında hibritize etmek üzere tasarlandığından emin olun. 3 ml PCR karışımı hazırlayın (1x yüksek kaliteli tampon, 200 μM deoksinükleosit trifosfat (dNTP'ler), 1 μM amplifikasyon astarı, 20 U/ml yüksek kaliteli DNA polimeraz) ve buz üzerine yerleştirilmiş 96 oyuklu bir PCR plakasında kuyucuk başına 29 μl dağıtın. ACCM-2'deki sabit fazdaki her mutantın 1 μl'sini PCR karışımına aktarın.
- PCR'yi ilk denatürasyon (98 °C, 1 dk), 20 yüksek sıkılık döngüsü (98 °C, 10 saniye; 50 °C, 30 saniye; 72 °C, 90 saniye), 30 düşük sıkılık döngüsü (98 °C, 10 saniye; 30 °C, 30 saniye; 72 °C, 90 saniye) ve 30 yüksek sıkılık döngüsü (98 °C, 10 saniye; 50 °C, 30 saniye; 72 °C, 90 sn) ve ardından 72 °C'de 7 dakika boyunca son bir uzatma yapılır.
- Manyetik boncuklar kullanarak PCR ürünlerini saflaştırın ve transpozona özgü bir primer ile DNA dizileyin. 50 ° C ile 75 ° C arasında bir tahmini erime sıcaklığı, %40 ile %60 arasında bir GC içeriği, 18 ila 25 nükleotid arasında bir uzunluk ve amplifikasyon primer hibridizasyon bölgesinin akış aşağısında bir tavlama bölgesi ve transpozon ITR'nin birinci baz çiftinin akış yukarısında en az 100 baz çifti ile transpozona özgü primeri tasarlayın.
- Dizi analiz yazılımını kullanarak, Coxiella burnetii 493 NMI'nin eksiksiz, açıklamalı genomunu yükleyin. Sıralama sonuçlarını yüklemek ve hizalamak (blastn) ve aktarma yerini belirlemek için "referansa hizala" işlevini kullanın. Eşleşmeyen ve/veya çift okuma görüntüleyen mutantları atın. Mutant kütüphanenin doygunluğunu izlemek için, aynı bölgede birden fazla transpozon eklemesinin oluşumunun kaydını tutun.
3. Coxiella Mutantları ile Ökaryotik Hücreler Mücadelesi ve Hücre İçi Büyümenin İzlenmesi
>NOT: Aşağıdaki adımlar için çok kanallı bir pipet önerilir. Enfeksiyonlar, siyah duvarlı ve düz şeffaf tabanlı steril 96 oyuklu mikroplakalarda üç kopya halinde gerçekleştirildi. GFP'yi ifade eden wt Coxiella burnetii Dr. Robert Heinzen tarafından sağlandı.
- Antibiyotik yokluğunda% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş fenol kırmızısı olmadan RPMI'de Vero hücrelerini büyütün (Tam RPMI ortamı).
- Enfeksiyondan bir gün önce, Vero hücrelerini 10 ml fosfat tamponlu salin (PBS) ile birleşik veya alt birleşik hücre kültürü şişesinden yıkayın.
- Hücre kültürü şişesine 1 ml tripsin EDTA çözeltisi ekleyerek Vero hücrelerini ayırın ve% 5 CO2 nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C'de 3 ila 5 dakika inkübe edin.
- Hücreleri 10 ml Tam RPMI ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri sayın ve ml başına 105 hücreli bir hücre süspansiyonu hazırlayın.
- Düz şeffaf bir tabana sahip siyah 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 100 μl hücre süspansiyonu dağıtın.
- Kuyucukların dibinde hücre yapışmasını kolaylaştırmak için oda sıcaklığında (RT) 400 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve gece boyunca 37 °C'de% 5 CO2 nemlendirilmiş bir atmosferde inkübe edin.
- RT'de Coxiella mutantlarını içeren 96 oyuklu plakaları çözün ve 150 μl bakteri süspansiyonunu fenol kırmızısı ve FBS içermeyen 300 μl RPMI'de derin bir kuyu 96 oyuklu plakada seyreltin.
- Vero hücreleri içeren mikroplakadan ortamı çıkarın ve 100 μl / kuyu seyreltilmiş Coxiella mutantlarını (100 MOI) dağıtın. Negatif (enfekte olmayan hücreler) kontrol olarak iyi A1'i ve pozitif kontroller olarak A2 ve A3 kuyularını kullanın (100 ve 200 enfeksiyon çokluklarında (MOI) GFP'yi eksprese eden wt Coxiella ile enfekte olmuş hücreler).
- Aerosol geçirmez bir santrifüj plaka tutucusu kullanarak plakayı RT'de 400 x g'da 10 dakika
santrifüjleyin.
- 37 ° C'de% 5 CO2 nemlendirilmiş bir atmosferde 2 saat inkübe edin, ardından bakteri içeren ortamı 100 μl / kuyu taze, tam RPMI ortamı ile değiştirin.
- Bir floresan mikroplaka okuyucu ve standart floresan dalga boyları (uyarma ~ 480 nm, emisyon ~ 520 nm) kullanarak 7 gün boyunca her gün GFP floresansını ölçün. Kültür ortamındaki yoğuşma ve sinyal dağılımından kaynaklanan paraziti önlemek için, mikroplaka okuyucuda alt uyarma ve emisyon kaydını kullanın.
4. Otomatik Görüntü Alımı için Numunelerin Hazırlanması
NOT: Prosedür 96 oyuklu bir plaka içindir, hacimleri buna göre ölçeklendirin. 4.2'den itibaren atılan adımlar bir plaka yıkayıcıdan yararlanabilir.
- Enfeksiyondan sonraki 7. günde, besiyerini plakadan çıkarın ve uygun seyreltmede (genellikle 1: 1,000, kullanılan hücre hattına göre optimize edilmek üzere) hücre geçirgen bir floresan boya içeren 50 μl / kuyu taze, tam besiyeri ile değiştirin. Hücreleri% 5 CO2 nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C'de 30 - 60 dakika inkübe edin.
- Ortamı PBS'de 50 μl / kuyucuklu %4 paraformaldehit (PFA) ile değiştirin, oda sıcaklığında (RT) 30 dakika inkübe edin, ardından PFA içeren tamponu çıkarın ve PBS ile 3 kez yıkayın.
- PBS'yi çıkarın ve% 0.05 saponin ile desteklenmiş 50 μl / kuyu bloke edici çözelti (% 0.5 sığır serum albümini, 50 mM amonyum klorür, PBS'de NH4Cl, pH 7.4) dağıtın. RT'de 30 dakika inkübe edin.
- Bloke etme solüsyonunu, saponin (yukarıdaki gibi) ile takviye edilmiş 40 μl / kuyu taze bloke etme solüsyonu ve 1:500 seyreltmede anti-lizozomla ilişkili membran glikoprotein-1 (anti-LAMP1) antikoru ile değiştirin. Plakayı RT'de 30 dakika inkübe edin.
- Bloke edici solüsyonu çıkarın ve 96 oyuklu plakayı 100 μl/kuyucuklu PBS ile 5 kez yıkayın.
- Adım 4.4'te uygulanan anti-LAMP1 antikorunu ortaya çıkarmak için saponin (yukarıdaki gibi), uygun floresan etiketli ikincil antikor (1: 1.000 seyreltmede) ile takviye edilmiş 40 μl / kuyu bloke edici solüsyon dağıtın ve Hoechst 33258 ile 5 μg / ml'de. RT'de 30 dakika boyunca plakayı inkübe edin.
- Bloke edici solüsyonu çıkarın ve 96 oyuklu plakayı 100 μl/kuyucuklu PBS ile 5 kez yıkayın. Sabit hücrelerin kurumaması gerektiğinden, son yıkamaya karşılık gelen PBS hacmini 96 oyuklu plakada bırakın.
- Plakayı hemen görüntüleyin veya daha sonraki analizler için plakayı ışıktan koruyarak 4 °C'de saklayın.
5. Görüntü Edinme
- GFP (488 nm, bakteri), Hoechst 33258 (350 nm, konak hücre çekirdeği), kırmızı (~555 nm, hücre zarı işaretleyicisi) ve uzak kırmızı (~615 nm, LAMP1) kanallarda 20X objektif ile donatılmış bir epifloresan otomatik mikroskop kullanarak görüntüler elde edin. Örnek başına en az 5.000 hücreyi görüntülemek için kuyu başına 21 bağımsız alan elde edin. Konak hücre çekirdeği kanalını referans olarak kullanarak otomatik odaklama uygulayın. Düşük bir konakçı hücre yüzdesini enfekte eden bakteriyel patojenlerle çalışırken, kullanıcılar analiz etmek için en az 500 enfekte hücre elde etmek için kuyu başına görüntülenen bağımsız alanların sayısını ayarlayabilir.
