Aşağıdaki protokoller, anaerobik türler olan P. gingivalis'in istilasını kültürleme ve inceleme yöntemlerini açıklayacaktır; ancak, bu protokoller bir dizi anaerobik patojen için kullanılabilir. HUVEC'ler kullanılmasına rağmen, bu protokol hem bağışıklık hem de bağışıklık olmayan diğer ökaryotik hücreler için kullanılabilir.
1. Anaerobik Oda Kullanımı ve Bakımı
Not: P. gingivalis, ortam havasında karşılaşılan normal oksijen seviyelerine duyarlı bir anaerobdur. Kontrollü bir anaerobik ortam, P. gingivalis yetiştiriciliği için hayati önem taşır.
- Burada, vinil anaerobik bir odada karışık anaerobik gaz (%80 N2,% 10 H2,% 10 CO2) olarak belirlenmiş yapay bir atmosfer sağlayın (Şekil 1A). Öğeleri laboratuvar ortamından anaerobik odaya aktarmak için bir hava kilidi (Şekil 1B) kullanın. Hava kilidi manuel olarak çalışır, karışık anaerobik gazı vermeden önce N2 gazı ile iki kez temizler.
- İstenmeyen hidrojen sülfürün bakım gerektirmeden uzaklaştırılması için bir hidrojen sülfür giderme kolonu (Şekil 1C) kullanın. Katalizör tarafından oluşturulan H2O'yu uzaklaştırmak ve kontaminasyonun yayılmasını kolaylaştıran aerosolleri önlemek için haznenin içine bir nem giderici yerleştirin.
not: Hidrojen sülfür, birçok anaerobik bakterinin doğal bir metabolik yan ürünüdür ve birikimi bakteriler için toksiktir ve elektronik aksamlara zarar verebilir ve bir katalizörün ömrünü kısaltabilir.
- Odanın atmosferini, hidrojen varlığında oksijeni uzaklaştıran bir paladyum katalizörü aracılığıyla dolaştırmak için bir fan kutusu kullanın (Şekil 1D).
Not: Devridaim atmosferik (yüksek verimli partikül hava veya HEPA) filtre, 0,22 μm veya daha büyük boyuttaki havadaki kirleticileri giderir.
- Anaerobik odanın içinde bulunan 37 ° C'lik bir inkübatörde anaerobik bakteri kültürü. Anaerobik oda içinde çalışırken standart aseptik teknikler kullanın.
>2. Anaerobik Bakterilerin Hazırlanması
Not: P. gingivalis aerotoleranttır ve aerobik koşullarda saklanabilir, ancak oksijen varlığında %6'dan daha yüksek seviyelerde büyümez. P. gingivalis ve diğer anaerobik türlerin uygun şekilde yetiştirilmesi için anaerobik bir oda gereklidir (Şekil 1). Mikro anaeroblarla çalışmadan önce anaerobik oda kullanımı konusunda uygun eğitim ve öğretim gereklidir.
- Kalan oksijeni gidermek için deneyden önce tüm sıvı ortamları ve plakaları en az 12 saat anaerobik koşullara dengeleyin.
- P. gingivalis'i -80 °C'lik bir dondurucudan anaerobik bir odaya aktarın ve çözülmeye bırakın.
- Triptikaz soya kanı agar plakaları üzerinde çizgi P. gingivalis (% 5 koyun kanı ile TSA II). Plakaları parafilme sarın ve 37 ° C'de anaerobik bir inkübatörde 4-7 gün saklayın.
- P. gingivalis'i, anaerobik ve titiz mikroorganizmaların izolasyonu ve kültürü için zenginleştirilmiş, seçici olmayan bir sıvı ortam olan hemin ve menadion ile desteklenmiş 3 ml'lik beyin kalp infüzyonu (BHI) suyuna steril döngüler kullanarak aşılayın.
not: Uzun süreli saklama için, BHI'de hazırlanan bakteri kültürlerini gliserol veya DMSO (%10-20 nihai konsantrasyon) ile karıştırın ve -80 °C'lik bir dondurucuya koyun.
- 1:10 oranında seyreltme yaparak ve bakterilerin orta log fazına kadar büyümesine izin vererek bir P. gingivalis başlangıç kültürü hazırlayın.
Not: Bakteriyel süspansiyonun optik yoğunluğu belirlenir ve incelenecek her suş için bakteri konsantrasyonu ayarlanır. P. gingivalis için OD660'ta 0.7'lik bir süspansiyon, orta log fazına ve ~ 7 x 108 hücre / ml'ye karşılık gelir. Yukarıdaki protokolde tarif edilen büyüme koşulları P. gingivalis için spesifiktir ve diğer bakteri suşları için uyarlanması gerekebilir.
3. Endotel Hücre Kültürü
>Not: Üreticinin talimatlarına göre %5 CO2 içinde 37 °C'de vasküler endotelyal büyüme faktörleri (VEGF) içeren bazal ortamda havuzlanmış birincil HUVEC'ler ve kültür satın alın.
- 15 ml VEGF ortamında 2,5 x 105 hücre/şişede T-75 şişelerindeki tohum HUVEC'leri.
not: %4.0 tripan mavisi ile 1:1 seyreltme yoluyla canlılığı kontrol edin. Riskli bir zara sahip hücreler tripan mavisini koruyacak ve sağlam zarlara sahip sağlıklı hücreler, binoküler ışık mikroskobu altında bakıldığında beyaz görünecektir. 100 hücre sayın ve hücrelerin %80'inden fazlasının canlı olduğundan emin olun.
- Hücreler ~% 80 birleşmeye ulaşana kadar ortamı her 2 günde bir önceden ısıtılmış taze VEGF ortamıyla değiştirin.
- Hücreleri önceden ısıtılmış fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile bir kez yıkayın. 2 ml tripsin-EDTA (% 0.25) ile 5 dakika inkübe ederek ve ardından 2 ml tripsin nötralize edici çözelti ile T75 şişesinden hücreleri serbest bırakın.
- Asılı HUVEC'leri 50 ml'lik konik bir tüpte toplayın. T-75 şişelerindeki fazla hücreleri PBS ile yıkayın ve 50 ml'lik konik tüplere aktarın.
- Hücreleri 10 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı çıkarın ve 10 ml önceden ısıtılmış VEGF ortamında hücre peletini askıya alın.
- Bir hemositometre veya benzeri bir hücre sayma cihazı kullanarak hücre konsantrasyonunu belirleyin.
- 6 oyuklu bir plakaya (400.000 / oyuk) veya lamel içeren 12 oyuklu bir plakaya (50.000 / oyuk) eklenecek hücre süspansiyonu miktarını hesaplayın. HUVEC'ler ertesi gün deney için hazır olacaklar.
4. Hayatta Kalma Testi İstilası/Etkileşimi (Kaplama)
Not: Bu testi gerçekleştirirken, 400.000 hücre/kuyucukta tohumlanmış iki adet 6 oyuklu endotel hücresi plakası hazırlayın. Bir plaka, konakçı hücrelere bağlanan ve içselleştirilen bakterileri değerlendirmek için kullanılacaktır. Diğer plaka hücre içi bakterileri hesaba katacaktır. 6 oyuklu plaka, bir deneyde iki numunenin üçlü olarak kopyalanmasına izin verir. Bu protokolün bir taslağı için lütfen hayatta kalma testi akış şemasına bakın (Şekil 2).
- Anaerobik bakterileri orta log büyümesine (OD660 0.5-0.7) ulaşana kadar yukarıda tarif edildiği gibi hazırlayın (bkz. bölüm 1).
- Bakterileri 5.000 x g'da 10 dk.
santrifüjleyin
Not: Santrifüj anaerobik bir odanın dışındaysa, bakteri örneklerini sıkıca kapatılmış 15 ml'lik bir tüpte taşıyın ve oksijen sızıntısını önlemek için kapağı parafilm ile sarın.
- Peletlenmiş P. gingivalis'i hazneye geri yerleştirin ve süpernatanı atın. VEGF ortamında yeniden süspanse etmeden önce PBS ve pelet bakterileri ile tekrar yıkayın. Orta log fazına (~ 7 x 108 hücre / ml) karşılık gelen 0.7 OD660'ta test edilecek tüm bakteri suşları için süspansiyonlar hazırlayın. Bakteriler artık enfeksiyon için hazırdır.
- HUVEC içeren 6 oyuklu plakaları doku kültürü inkübatöründen anaerobik odaya aktarın. Ortamı çıkarın ve anaerobik PBS ile üç kez yıkayın. Her oyuğa 2 ml anaerobik VEGF ortamı ekleyin ve enfeksiyon sıcaklığını dengelemek için plakaları 37 ° C'de anaerobik inkübatörde 20 dakika boyunca yerleştirin.
not: Enfeksiyon için kullanılanların homojen olmasını ve enfeksiyon üzerine kontamine olmamasını sağlamak için kanlı agar plakaları üzerindeki bakteri plakaları.
- 100:1.
'lik bir enfeksiyon çokluğunda (MOI bakterileri: konakçı) konakçı hücreleri bakterilerle enfekte edin
not: HUVEC hücre sayısı, enfeksiyondan önce tek bir kuyucuk üzerinde tripan dışlama testi yapılarak belirlenir. Bakteri hücre sayısı optik yoğunluk ile belirlenir (örneğin, 0.5 = 5 x 108 hücre / ml OD). Bakteri konsantrasyonu, HUVEC'in konsantrasyonuna bağlı olarak uygun MOI'ye ayarlanır.
- Enfekte HUVEC'leri olan 6 oyuklu plakaları anaerobik inkübatöre yerleştirin ve bakterilerin 30 dakika boyunca konakçı hücrelerle etkileşime girmesine izin verin.
- Anaerobik odanın içinde BHI (a/h% 1.0) içinde saponin hazırlayın ve 0.2 μm'lik bir filtreden süzün.
- Hem bağlı hem de içselleştirilmiş bakterilerin hayatta kalması.
- Plakaları inkübatörden çıkarın, ortamı aspire edin, anaerobik PBS ile üç kez yıkayın ve 2 ml filtrelenmiş% 1.0 saponin ekleyin (adım 4.8'de açıklandığı gibi hazırlanır). Konak hücre lizizine izin vermek için 15 dakika inkübe edin.
- Her kuyucuğun dibini bir hücre kazıyıcı ile kazıyın. Hücre karışımını her bir oyuktan toplayın ve BHI'da 1: 1 oranında seyreltme yapın.
- Numunenin seri seyreltmelerini yapmaya devam edin. Bakteri türüne ve konsantrasyonuna bağlı olarak, seri seyreltmeleri ayarlayın. 1:100 veya 1:1.000 seyreltme ile başlayın.
- Kan agar plakaları üzerinde 200 μl istenen seyreltme plakası. Plakaları parafilme sarın ve 37 °C'deki anaerobik inkübatöre yerleştirin.
- 37 °C'de yedi günlük inkübasyonun ardından, plakaları çıkarın ve kolonileri manuel olarak saymak için bir ışık kutusu kullanarak koloni oluşturan birimleri (CFU'lar) sayın.
not: CFU'lar numaralandırılır. Daha büyük miktarlarda CFU için, CFU'ların numaralandırılmasını kolaylaştırmak için görüntüler alınabilir ve bilgisayar yazılımı kullanılabilir.
