$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Bakterilerin Konak Hücrelere İçselleştirilmesi (Floresan Mikroskopi)
Not: P. gingivalis 2',7'-Bis-(2-Karboksietil)-5- (ve-6)-Karboksifloresein, Asetoksimetil Ester (BCECF-) ile etiketlenmiştir. BCECF-, floresan olmayan membran geçirgen bir boyadır; hücre içi esterazların etkisi yoluyla floresein BCECF'ye dönüşümü, hücre canlılığını gösterebilir. P. gingivalis, BCECF-boyası ile etiketlenir ve daha sonra ökaryotik hücreleri enfekte etmek için kullanılır. Enfeksiyonu takiben, hücreler DAPI ve TRITC-phalloidin ile sabitlenir ve etiketlenir. Ökaryotik hücre çekirdeğini boyamak için kullanılan DAPI boyası, BCECF-'yi metabolik olarak parçalayamayan canlı olmayan bakterileri tanımlamak için bir karşı önlem sağlayan bakteri hücre çekirdeğini de etiketleyecektir. Konak hücreler, kırmızı bir aktin boyası olan TRITC-phalloidin ile vurgulanır.
- Otoklav lamelleri. Endotel hücrelerini 5 x 104 hücre / kuyucukta tohumlamadan önce 12 oyuklu plakalara aseptik olarak lameller ekleyin. (Deneyden bir gün önce hazırlanmıştır)
- Yukarıda tarif edildiği gibi 12 oyuklu plakalarda 18 mm (# 1.5 kalınlık) dairesel lameller üzerinde hazırlanmış endotel hücrelerine sahip olun.
- Orta log fazına kadar büyüyen anaerobik bakterileri hazırlayın (OD660 = 0.5-0.7).
- 5.000 x g'da santrifüjleyerek ve peleti PBS'de 5-7 x 108 hücre / ml'de süspanse ederek bakterileri 2x anaerobik PBS ile yıkayın.
- 2 μM'lik nihai BCECF-konsantrasyonuna 2 ml bakteri süspansiyonuna (5-7 x 108 hücre / ml) 20 μl 0.2 mM BCECF-ekleyin.
- Karanlıkta 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
- 18 mm (# 1.5 kalınlıkta) dairesel lameller üzerine ekilen endotel hücreli plakaları doku kültürü inkübatöründen anaerobik odaya aktarın. PBS ile yıkayın ve anaerobik VEGF media ile değiştirin.
Not: HUVEC'lerin ışık mikroskobu altında sağlıklı olduğunu doğrulayın. HUVECS ~% 80 birleşik olmalı, morfoloji üreticilerle karşılaştırılabilir olmalıdır.
- Artık BCECF-boyasını çıkarmak için etiketli bakterileri 5.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. 2 ml anaerobik VEGF ortamında süspanse edin.
- Konakçı hücreleri 100: 1 MOI'de etiketli bakterilerle enfekte edin (bakteri: konakçı).
- Anaerobik bir odada 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
- Enfeksiyondan sonra hücreleri PBS ile üç kez yıkayın ve taze hazırlanmış% 4.0 paraformaldehiti 10 dakika boyunca
sabitleyin
not: Hücreleri sabitledikten sonra, anaerobik odanın dışında deneyler yapılabilir.
- Lamelleri PBS ile üç kez yıkayın.
- 10 dakika boyunca 1 ml% 0.2 Triton X-100 ekleyin.
- Lamelleri PBS ile üç kez yıkayın.
- Lamellere 45 dakika boyunca 50 μl TRITC phalloidin (50 μg/ml) ekleyin.
- Lamelleri üç kez yıkayın, 12 oyuklu plakadan çıkarın ve DAPI içeren yumuşak ayarlı bir montaj ortamına sahip bir slayt üzerine yerleştirin. Yanları oje ile kapatın.
not: Slaytlar karanlıkta birkaç ay saklanabilir. Foto ağartmayı önlemek için ışığa maruz kalmaktan kaçının.
- Konfokal mikroskop kullanarak slaytları görüntüleyin.
- Burada, motorlu bir XY aşamasına sahip bir AxioObserver (ters) stand etrafında yapılandırılmış 34 kanallı bir spektral sistem (32 kanallı dizi dedektörü ve iki yan PMT dedektörü, ayrıca bir iletilen ışık dedektörü) kullanın. Sistemin beş lazeri vardır: mavi diyot (405 nm), çok hatlı Argon (458, 488, 514 nm), yeşil diyot (561 nm), kırmızı HeNe (633 nm) ve 440 nm darbeli lazer. Bir Floresan Ömür Boyu Görüntüleme sistemini 2 hibrit GaAsP dedektörü (FRET-FLIM için) ile donatın.
- 340-380 nm ve 540-560 nm uyarma dalga boylarına sahip çift bantlı bir filtre ve sırasıyla 435-485 nm ve 570-590 nm'lik bir emisyon filtresi kullanarak DAPI ve TRITC'den gelen floresansı tek bir kanalda tespit edin. 440-500 nm uyarma dalga boyuna sahip bir filtre ve 510-590 nm emisyon filtresine sahip bir filtre kullanarak BCECF-'den gelen floresansı tespit edin.
not: Canlı bakterilerin uygun şekilde etiketlenmesini sağlamak için incelenen her bakteri suşu üzerinde BCECF-kontrolleri yapılmalıdır. İlk olarak, cansız bakterilerin DAPI pozitif ve BCECF negatif olduğunu doğrulayın. İkincisi, canlı bakterilerin BCECF-'yi floresein BCECF'ye metabolize edebildiğinden emin olun. Optimum etiketleme için değişken bakteri konsantrasyonlarının veya BCECF-boyasının test edilmesi gerekebilir.