1. HL-60 Hücrelerinin Kültürü, Farklılaşması ve Validasyonu
- L-glutamin ve 50 mL ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu içeren 500 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) içeren HL-60 hücre kültürü ortamını hazırlayın. HL-60 hücrelerinin farklılaşmasını etkileyebileceğinden antibiyotik eklemeyin.
- HL-60 hücrelerinin çoğaltılması/bakımı için, 37 ° C'de 75 cm2 havalandırmalı şişelerde 10 mL HL-60 hücre kültürü ortamında 5 x10 6 hücre kültürü ve% 5 karbondioksit (CO2) kültürü. Optimal hücre konsantrasyonlarını korumak için her 3-4 günde bir hücreleri geçiştirin.
not: Hücre konsantrasyonu 5 x 106 / mL'yi geçmemelidir.
- %10 dimetil sülfoksit (DMSO) içeren HL60 kültür ortamında yaklaşık 1 x10 6 hücre/mL'yi 1 mL kriyojenik tüplere alikode ederek HL-60 hücrelerinin çalışma stoklarını oluşturun.
not: Çalışma stokları -80 °C'de saklanabilir. Ana stok -120 °C'de saklanmalıdır.
- HL-60 hücrelerini, opsonofagositik öldürme aktivitesinden (OPKA) 3 gün önce 37 ° C'de% 0.6 N, N-dimetilformamid (DMF) ve% 5 CO2 ile% 0.6 N, N-dimetilformamid (DMF) ve% 5CO2 ile 15 mL HL-60 hücre kültürleyerek ayırt edin.
- HL-60 hücrelerinin başarılı bir şekilde farklılaştığını ve yerleşik akış sitometrisi protokollerine göre canlılığı ve hücre yüzeyi belirteçlerini test ederek OPKA testinde kullanım için uygun olduğunu doğrulayın. Farklılaşmadan sonra, HL-60 hücrelerini hasat edin ve yaklaşık 1 x 104 hücreyi CD71, CD35, annexin V ve propidium iyodür için floresan konjuge antikorlar/boyalarla boyayın.
not: Farklılaşmış hücreler, yerleşik doğrulama protokolleri ile belirlendiği gibi %≥65 canlı, %≥55 CD35+ ve %≤20 CD71+ olmalıdır (Şekil 1).
2. OPKA Tamponlarının ve Reaktiflerinin Hazırlanması
- 42.5 mL steril 1x fosfat tamponlu salin (PBS) Ca2 + / Mg2 +, 5 mL ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu ve 2.5 mL% 0.1 steril jelatin ile karıştırarak 50 mL steril opsonizasyon tamponu B (OBB) hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
- Yavru tavşan tamamlayıcısı edinin ve -80 °C'de saklayın.
- Bakteri kültürü plakaları edinin veya hazırlayın (yani, 15 x 100 mm2 %5 koyun kanı agar plakaları).
3. Bakteri Stok Numunelerinin Hazırlanması
- Test edilecek bakteri suşunun (suşlarının) bir stoğunu elde edin.
NOT: Bu protokol için serotip 3 Streptococcus pneumoniae (WU2, Dr. Moon Nahm tarafından cömertçe sağlanır) kullanılır.
- Bakteri türünü uygun bir et suyunda (yani, Todd-Hewitt suyu + bu WU2 suşu için% 0.5 maya özütü) 37 ° C'de yaklaşık 2-4 saat boyunca büyütün.
not: Kültürün 600 nm'deki (OD600) optik yoğunluğu 0.6 ile 0.8 arasında olmalıdır.
- Bakterileri 2 dakika boyunca 6.000 x g'da santrifüjleme ile pellet yapın ve hücreleri uygun et suyunda 10-30 mL% 15 gliserol içinde yeniden süspanse edin. Bakteri kültürünü (alikot başına 500 μL) steril 1.5 mL santrifüj tüplerine alın ve -80 ° C'de saklayın.
- 37 ° C'lik bir su banyosunda bir şişe bakteri stoğunu çözdürün. Bakteri hücrelerini peletleyin ve steril koşullar altında 500 μL OBB içinde yeniden süspanse edin.
- OBB'de bakteri stoğunun farklı seyreltmelerini hazırlayın (yani, 10 μL seyreltme yok, 10 μL 1:10, 10 μL 1:100, vb.). OPKA testini (HL-60/kompleman ko-kültürü dahil olmak üzere bölüm 4-6), işlenmemiş bakteri stoğunun çeşitli seyreltmelerini kullanarak aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirin. Plakaları gece boyunca 30 °C'de (CO2 yok) kültürleyin.
not: 30 °C'lik sıcaklık, aşırı büyümeyi önlemek için WU2'ye özgüdür; diğer suşlar/serotipler 37 °C'de optimal olarak büyüyebilir.
- HL-60 hücreleri ve kompleman ile birlikte kültürlenmiş işlenmemiş bakteri stoğunun her seyreltilmesi için kolonileri sayın. Hangi bakteri seyreltmesinin optimal sayılabilir koloni sayısını verdiğini belirleyin (HL-60 hücreleri ile birlikte kültürlenmiş tedavi edilmemiş bakteriler için yaklaşık 80-120 koloni oluşturan birim (CFU)). Bu bakteri stoğunu içeren gelecekteki OPKA'lar için bu seyreltmeye dikkat edin.
4. Bakteri Tedavisi ve Kültürü
- Adım 3.3'te hazırlanan bir tüp bakteri suyunu çözdürün. Pelet bakterileri (2 dakika boyunca 6.000 x g) ve adım 3.6'da belirlendiği gibi optimum seyreltmede OBB'deki hücre peletini yeniden süspanse edin.
- Yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir hücre kültürü plakasında oyuk başına 10 μL yeniden süspanse edilmiş bakteri seyreltmesini pipetleyin.
- Her deneysel kuyucuğa 20 μL uygun antikor veya ilaç tedavisi ekleyin.
NOT: Bu protokolde, farelerde üretilen serotipe özgü bir antikor, tedavi X olarak eklenir ve serotip 3 polisakkarit kapsülünü parçaladığı bilinen bir glikozit hidrolaz enzimi, tedavi Y olarak eklenir (Şekil 2). Kontrol kuyuları için, arıtma kuyuları için kullanılan tampona bağlı olarak 1x PBS veya OBB kullanın.
- S'yi çalkalayınample90 amp oda sıcaklığında 1 saat boyunca yaklaşık 1 rpm'de. Bu koşulları, test edilen tedavilerin optimum sıcaklık veya çalkalama koşullarına bağlı olarak ayarlayın.
>5. HL-60 bakteri Ko-kültürü
- Üç gün önce DMF ile muamele edilen HL-60 farklılaşmış hücreleri (bkz. adım 1.4) 15 mL konik tüplere hasat ederek HL-60 hücrelerini hazırlayın. Hücreleri pelet haline getirin (500 x g, 3 dakika), süpernatanı atın ve en az 10 mL 1x PBS ile yıkayın.
- Yıkanmış hücreleri (500 x g, 3 dakika) peletleyin, süpernatanı atın ve hücreleri OBB'de yeniden süspanse edin (1 mL OBB ile başlayın ve hücre sayımından sonra 1 x 107 / mL'lik bir nihai konsantrasyona ayarlayın).
- Bebek tavşan tamamlayıcısını (steril, seyreltilmemiş bebek tavşan serumu, 3-4 haftalık yaş) 1:5 son hacimde ekleyin.
not: HL-60 tamamlayıcı karışımının nihai konsantrasyonu 1 x 107 / mL olmalıdır. Kompleman bağımlılığı test ediliyorsa, ısıyla inaktive edilmiş kompleman ile aktif HL-60 hücreleri içeren ikinci bir çözelti kullanılabilir (kompleman >55 ° C'de en az 30 dakika boyunca bir su banyosunda inkübe edilerek inaktive edilebilir).
- 1 saat bakteri kültürü tamamlandıktan sonra (adım 4.4), her bir numuneyi (yani, her 30 μL'lik numunenin 10 μL'sini iki yeni oyuklara) iki grup için çift oyuklara bölün (yani, pipetleme hatasını hesaba katmak için orijinal 30 μL'lik ko-kültürün yalnızca 20 μL'sini kullanın): bir set HL-60 tamamlayıcısı ile birlikte kültürlenecek ve biri yalnızca bakterileri içerecektir. Her deneysel kuyucuk setine (delege edilmiş + HL-60) 50 μL HL-60 tamamlayıcı karışımı (adım 5.3'ten itibaren) ekleyin; sadece bakteri kuyucuklarına tek başına 50 μL OBB ekleyin (delege -HL-60).
not: Bu örnek için, 5 x 105/50 μL HL-60 hücreli ilk ko-kültür için yaklaşık 800 bakteriyel CFU kullanılır. Bu enfeksiyon çokluğu, son koloni sayılarıyla gösterildiği gibi çok yüksek veya çok düşükse, HL-60 hücre sayısının aksine ilk bakteri seyreltmesini ayarlayın.
- 96 oyuklu plakayı 37 °C'de 1 saat çalkalayın (CO2 yok).
>6. Numune Kaplama ve Gece Boyunca İnkübasyon
- Her bir numunenin hacmi en az 50 μL olacak şekilde her bir kuyucuğu 1:5 oranında OBB ile seyreltin.
- Her numuneden 50 μL'yi doğrudan bir bakteri kültürü plakasının belirlenmiş bir alanına pipetleyin ve numuneler arasında yeterli boşluk bırakın. 15 x 100 mm'lik2 yuvarlak agar plakası için, bir plakaya yaklaşık 4 numune pipetleyin.
- Numunelerin üzerini örtün ve oda sıcaklığında yaklaşık 15 dakika kurumasını bekleyin.
- Plakaları ve kültürü gece boyunca 30 ° C'de ters çevirin (CO2 yok). Alternatif olarak, anoksik koşulların bakteri üremesini etkileyip etkilemediğini test etmek veya morfolojiyi kontrol etmek için anaerobik kavanozlardaki kültür plakaları.
- Gece boyunca kültürden sonra, belirlenen her numune alanındaki kolonileri sayın. Her setteki canlı hücre sayısını, HL-60 hücre ko-kültürü almayan ilgili kontrol ve/veya örneklerle karşılaştırarak verileri analiz edin (%100 hücre sağkalımı, %0 hücre öldürme göstergesi).
