Konak Endotel Hücrelerinde İçselleştirilmiş Porphyromonas gingivalis'in Değerlendirilmesi

Özet

Kaynak: Wunsch, C. M., et al. Anaerobik Bakterilerin Konakçı Hücrelerle Etkileşimini Değerlendirmek için Model Organizma Olarak Porphyromonas gingivalis. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu videoda, Porphyromonas gingivalis'in insan endotel hücreleri içindeki sağkalımını değerlendirmek için bir test gösteriyoruz. İçselleştirilmiş Porphyromonas gingivalis'in sağkalım ve büyüme ölçüsü, kan agar plağı üzerindeki koloni sayısı ile değerlendirilir.

Protokol

1. İçselleştirilmiş bakterilerin hayatta kalması.

1. P. gingivalis anaerobik bakterilerini orta log büyümesine ulaşana kadar hazırlayın (OD₆₆₀ 0.5-0.7).
2. Bakterileri 10 dakika boyunca 5.000 x g'da santrifüjleyin.
3. Peletlenmiş P. gingivalis'i hazneye geri yerleştirin ve süpernatanı atın. VEGF ortamında yeniden süspanse etmeden önce PBS ve pelet bakterileri ile tekrar yıkayın. Orta log fazına (~ 7 x 10⁸ hücre / ml) karşılık gelen 0.7 OD_660'ta test edilecek tüm bakteri suşları için süspansiyonlar hazırlayın. Bakteriler artık enfeksiyon için hazırdır.
4. HUVEC içeren 6 oyuklu plakaları doku kültürü inkübatöründen anaerobik odaya aktarın. Ortamı çıkarın ve anaerobik PBS ile üç kez yıkayın. Her oyuğa 2 ml anaerobik VEGF ortamı ekleyin ve enfeksiyon sıcaklığını dengelemek için plakaları 37 ° C'de anaerobik inkübatörde 20 dakika boyunca yerleştirin.
5. 100:1.
   'lik bir enfeksiyon çokluğunda (MOI bakterileri: konakçı) konakçı hücreleri bakterilerle enfekte edin not: HUVEC hücre sayısı, enfeksiyondan önce tek bir kuyucuk üzerinde tripan dışlama testi yapılarak belirlenir. Bakteri hücre sayısı optik yoğunluk ile belirlenir (örneğin, 0.5 = 5 x 10⁸ hücre / ml OD). Bakteri konsantrasyonu, HUVEC'in konsantrasyonuna bağlı olarak uygun MOI'ye ayarlanır.
6. Enfekte HUVEC'leri içeren 6 oyuklu plakaları anaerobik bir inkübatöre yerleştirin ve bakterilerin 30 dakika boyunca konakçı hücrelerle etkileşime girmesine izin verin.
7. Anaerobik odanın içinde BHI (a/h% 1.0) içinde saponin hazırlayın ve 0.2 μm'lik bir filtreden süzün.
8. Plakaları inkübatörden çıkarın. Anaerobik PBS ile üç kez yıkayın ve 2 ml VEGF besiyerini antibiyotik takviyesi (300 μg/ml gentamisin ve 400 μg/ml metronidazol) ekleyin.
9. 1 saat inkübe edin. Antibiyotikleri, istenen bakteri türünü öldürmede% 100 etkili olacak şekilde test ettiğinizden ve konakçı hücrelere nüfuz etmediklerinden emin olun.
10. Aspirat ortamı, 2 ml filtrelenmiş% 1.0 saponin ekleyin. Konak hücre lizizine izin vermek için 15 dakika inkübe edin.
11. Her kuyucuğun dibini bir hücre kazıyıcı ile kazıyın. Hücre karışımını her bir oyuktan toplayın ve BHI'da 1: 1 oranında seyreltme yapın.
12. Numunenin seri seyreltmelerini hazırlayın (1:100, 1:1.000).
13. Kan agar plakaları üzerinde 200 μl istenen seyreltme plakası. Plakaları parafilme sarın ve anaerobik bir inkübatöre yerleştirin.
14. 37 ° C'de yedi günlük inkübasyondan sonra plakaları çıkarın ve CFU'ları sayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Vinil Anaerobik Oda Tip B	Coy Laboratuvar Ürünleri		Model 2000 kuluçka makinesi
TSA II Triptikaz Soya Agar, %5 Koyun Kanı ile	Bbl	221261
İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücreleri 10 Donör Havuzu	LifeLine Teknolojisi	FC-0044
VascuLife VEGF Medium Komple Kit	LifeLine Teknolojisi	LL-0003 (
Deneme Kiti	Yaşam çizgisi	LL-0013
Saponin	Riedel-de Haen	16109
Gentamisin Sülfat Tuzu	Sigma-Aldrich	G-1264
Metronidazol	Sigma-Aldrich	M-3761