Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Antikorların ekspresyonu ve saflaştırılması
- Çin hamster yumurtalık (CHO) hücrelerinin bakımı
- 37 ° C'de ticari olarak temin edilebilen 1x glutamin takviyesi ile desteklenmiş, 130 rpm'de %5 CO2 ile çalkalanarak, cam veya tek kullanımlık delong Erlenmeyer şişeleri kullanılarak FreeStyle CHO Media'da CHO hücrelerini büyütün.
not: Daha fazla çalkalama ve çalkalama koşulları sırasında gaz transferini iyileştirmek için havalandırmalı kapaklı şaşkın bir şişe kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Süspansiyon kültürünün sınırlı ajitasyonu nedeniyle düzenli şişelerle (şaşırtılmamış) önemli ölçüde azaltılmış antikor verimi elde edilmiştir.
- Hücre sayısını %>95 hücre canlılığı ile 1-5 x 106 hücre / mL arasında tutun. Hücre sayısı 5 x 106 hücre / mL'nin üzerine çıkarsa, hücreleri bölün. CHO hücrelerinin 0,2 x 106 hücre / mL'nin altına ulaşmasına asla izin vermeyin.
- CHO hücrelerinin transfeksiyonu
- Delong Erlenmeyer şaşkın şişelerde 200 mL ortamda (2 x 106 hücre / mL) CHO hücrelerini büyütün.
not: Şaşkın şişelerde yetiştirilen süspansiyon kültürleri, şaşkın şişelerde yetiştirildiğinde her zaman daha yüksek protein verimi üretmiştir.
- 15 mL'lik bir tüpte 5 mL CHO FreeStyle ortamı alın ve 50 μg VH klon DNA'sı ve 75 μg VL klon DNA'sı ekleyin. İyi karıştırmak için girdap.
- DNA karışımını oda sıcaklığında 5 dk.
inkübe edin
not: Daha uzun inkübasyon protein verimini azaltır.
- DNA çözeltisine 750 μL 1 mg / mL polietilenimin (PEI) stoğu ekleyin ve karışımı 30 saniye boyunca agresif bir şekilde girdaplayın. 5 dakika daha oda sıcaklığında inkübe edin
not: PEI taze yapılmalıdır. PEI'nin çoklu donma-çözülme döngüleri, toplam verimi önemli ölçüde azaltır.
- Şişeyi manuel olarak sallarken tüm DNA ve PEI karışımını hücrelere ekleyin. Delong Erlenmeyer şaşkın şişeleri 37 ° C'de hücrelerle hemen inkübe edin ve 130 rpm'de çalkalayın.
- İfade
not: Antikor, antikorların ortama salgılanmasına yardımcı olan N-terminal ucuna göre tasarlanmış bir salgı sinyal peptidine sahiptir.
- Transfekte edilmiş hücreleri 37 ° C'de, 1. günde 130 rpm'de çalkalayarak büyütün.
- 2. Günde, 2 mL 100x topaklanma önleyici ajan ve 2 mL 100x anti-bakteriyel-anti-mikotik çözelti ekleyin. Şişeyi 32 rpm'de çalkalayarak daha düşük bir sıcaklığa (34-130 °C) kaydırın.
- Her beş günde bir, 10 mL Tripton N1 beslemesi ve 2 mL 100x glutamin takviyesi ekleyin.
