$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Mtb ile enfekte monosit türevi hücrelerin akış sitometrisi boyaması
NOT: Aşağıdaki adımlar bir BSL-3 tesisinde gerçekleştirilmelidir. Akış sitometrisi boyama, tüpler yerine 96 oyuklu bir plakada gerçekleştirilebilir.
- Mycobacterium tuberculosis, Mtb ile enfekte olmuş hücreleri (ve enfekte olmamış kontrolleri) 37 ° C'de en az 30 dakika boyunca 37 ° C ve% 5 CO2'de kuyu başına 1 mL FACS tamponu ile inkübe ederek 6 kuyulu plakadaki kuyulardan ayırın.
- Hücrelerin ayrıldığından emin olmak için birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Mümkünse, hücre ayrılmasını mikroskopi ile onaylayın. Hücre süspansiyonunu her bir kuyucuktan vidalı kapaklı bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve tüpleri 5 dakika boyunca 200 x g'da döndürün. Süpernatanı pipetleyerek dikkatlice atın.
- Hücre peletini her tüpte FACS tamponu ile iki kez yıkayın ve hücreleri 5 dakika boyunca 200 x g'da döndürün.
- Hücreleri (yaklaşık 0.5 x 106 ila 1 x 106 hücre / tüp) TLR2 (AF647), CD206 (APC-Cy7), CD163 (BV605), CD80 (BV650), CCR7 (BV711), CD86 (BV786), CD200R (PE), CD64 (PE-Dazzle 594), HLA-DR (PE-Cy5) (Tablo 1) dahil olmak üzere yaklaşık 50 μL florokrom konjuge anti-insan antikor kokteyli ile karanlıkta 4 ° C'de (buzdolabı) 30 dakika boyunca renklendirilebilirlik boyası Zombie-UV ile birlikte boyayın.
- Lekeli hücreleri 400 μL FACS tamponu ile iki kez yıkayın ve hücreleri 5 dakika boyunca 200 x g'da döndürün.
- Mikobakterilerin tamamen inaktivasyonunu sağlamak için lekeli hücreleri karanlıkta RT'de 30 dakika boyunca 200 μL fiksasyon tamponu (taze hazırlanmış) ile sabitleyin.
- Hücreleri 400 μL FACS tamponu ile iki kez yıkayın ve fazla sabitleme tamponunu çıkarmak için 5 dakika boyunca 200 x g'da döndürün.
- Sabit hücreleri 400 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve numuneleri BSL-2'de akış sitometrisi için BSL-3 laboratuvarından çıkarmadan önce yeni 1 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Lekeli hücreleri numune alınana kadar +4 °C'de saklayın.
not: Tüpleri BSL-70 laboratuvarından çıkarmadan önce %3 etanol püskürtün. Formaldehit toksiktir (kanserojendir) ve sınıf II biyogüvenlik kabininde kullanılmalıdır. Formaldehit atıklarını ayrı bir kimyasal atığa atın.
2. Mtb ile enfekte monosit türevi hücrelerin akış sitometrik veri toplama ve analizi
NOT: Adım 2.1–2.2, yukarıda açıklanan akış sitometrisi boyamasından önce gerçekleştirilmelidir. Hücre fiksasyonundan sonra hücre topaklanması ve tandem boyaların ayrışması ile ilgili sorunları önlemek için, hem Mtb ile enfekte olmuş hem de enfekte olmamış hücrelerin numune alımı, birincil antikor boyamadan sonra 4-10 saat içinde gerçekleştirilir.
- Yukarıda tarif edilen akış sitometrisi boyamadan önce, kompanzasyon boncukları (hem pozitif hem de negatif) kullanarak boyama panelinde (Tablo 1) listelenen her florokrom konjuge antikor için floresan sinyalini telafi edin.
- Her florokrom için en uygun sinyali elde etmek için insan makrofajlarının boyanması için antikor seyreltmesini titre edin.
- Negatif hücre popülasyonu için bir kapı ayarlamak için gerekli arka plan floresan seviyesini belirlemek için boyanmamış hücreler kullanın ve lekeli hücrelerin görüntülenmesine izin verin (makrofajlar yüksek oranda otomatik floresandır).
- Veri toplama için önerilen yazılımı kullanarak akış sitometresinde en az 50.000 hücre / numune alın.
- Alma dosyalarını akış sitometresinden akış sitometrisi standardı (FCS) formatı 3.1'de dışa aktarın.
- Akış sitometrisi analiz yazılımında FCS dosyalarını analiz edin.
- Makrofajları ileri ve yan saçılma (FSC ve SSC) özelliklerine göre kapatın ve Zombi-UV canlılık boyasını kullanarak canlı/ölü hücre geçitlemesi ile ölü hücreleri dışlayın.
- FITC kanalındaki H37Rv-GFP ile enfekte makrofajları görselleştirin.
- Tüm belirteçler için pozitif boyanmış hücrelerin sıklığını ve geometrik ortalama floresan yoğunluğunu (MFI) tanımlayın (Tablo 1).
Tablo 1: Akış sitometrisi için kullanılan antikorların listesi.
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
)
Serisi
Serisi
Serisi
| lazer | filtre | Florokrom | fenotip | fonksiyon | Klon | Katalog no. | şirket |
| 639 | 670/30 | AF647 | TLR2 | Patojen tanıma reseptörü | 2,1 TL | 309714 | Biyo Efsane |
| 639 | 780/60 | APC-CY7 | CD206 | Mannoz reseptörü | 15-2 | 321120 | Biyo Efsane |
| 405 | 610/20 | BV605 | CD163 | Çöpçü reseptörü | GHI/61 | 333616 | Biyo Efsane |
| 405 | 670/30 | BV650 | CD80 | Ko-uyarıcı molekül | 2D10 | 305227 | Biyo Efsane |
| 405 | 710/50 | BV711 | CCR7 | Kemokin reseptörü | G043H7 | 353228 | Biyo Efsane |
| 405 | 780/60 | BV785 | CD86 | Ko-uyarıcı molekül | IT2.2 (BT2.2 | 305442 | Biyo Efsane |
| 488 | 530/30 | GFP (GFP) | Mtb | Hücre içi bakteriler | | | |
| 561 | 586/15 | Pe | CD200R Serisi | İnhibitör reseptör | ÖKÜZ-108 | 329306 | Biyo Efsane |
| 561 | 620/14 | PE/GÖZ KAMAŞTIRICI 594 | CD64 | IgG'nin Fc gama reseptörü-I | 10.1 | 305032 | Biyo Efsane |
| 561 | 661/20 | PE-CY5 (PC5) | HLA-DR (Radyo Frekansı) | MHC sınıf II molekül | L243 | 307608 | Biyo Efsane |
| 355 | 450/50 | BUV395 | Canlılık Boyası | Canlı/ölü hücre işaretçisi | Zombi UV | 423108 | Canlandırıcı |