Sitokin ile İndüklenen Öldürücü Hücrelerin Sitotoksik Yeteneğini İncelemek İçin Bir İn Vitro Test

Özet

Kaynak: Hsiao, C. H., et al. Kanser Tedavisi için Sitotoksik Sitokin ile İndüklenen Öldürücü T Hücrelerinin İzolasyonu ve Genişletilmesi. J. Vis. Exp. (2020).

Bu video, sitokin kaynaklı öldürücü (CIK) hücrelerin kanser hücrelerine karşı sitotoksik yeteneğini ölçmek için kullanılan bir in vitro tekniği göstermektedir. Hedef kanser hücrelerinin CIK hücreleri ile birlikte kültürlenmesi üzerine, ölü kanser hücreleri bir floresan canlılık boyası kullanılarak tanımlanır ve CIK hücrelerinin sitotoksik etkisini tahmin ederek akış sitometrisi kullanılarak ölçülür.

Protokol

İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Malzemelerin hazırlanması

1. Reaktifleri, antikorları ve kimyasalları Malzeme Güvenlik Bilgi Formunda (MSDS) gösterildiği gibi saklayın. İlaçları veya sitokinleri çözücüler içinde stok çözeltileri olarak çözün ve daha sonra -20 ° C veya -80 ° C'de saklamak için alikot edin.
   not: Materyal hazırlığı ile ilgili detaylı bilgi Malzeme Tablosunda belirtilmiştir.

2. Periferik kan mononükleer hücre (PBMC) izolasyonu

1. Kullanmadan önce yoğunluk gradyan çözeltisini (Malzeme Tablosu) 18–20 °C'ye ısıtın. İyice karıştırmayı sağlamak için çözelti şişesini birkaç kez ters çevirin.
2. Heparinize edilmiş bir şişede 3-5 mL insan venöz kan örneği toplayın ve tüpü birkaç kez hafifçe ters çevirerek iyice karıştırın.
3. 15 mL steril bir tüpte 4 mL yoğunluk gradyan çözeltisi hazırlayın.
4. Kan örneğinin 1 mL'sini yoğunluk gradyan çözeltisi üzerine dikkatlice katmanlayın.
5. 18−20 °C'de 30 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin (kesmeyi kapatın).
6. Mononükleer hücrelerin buffy coat tabakasını (yaklaşık 1 mL) bir kerede aspire edin ve katmanları 1 mL'lik steril bir pipet kullanarak steril 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
7. Santrifüj tüpündeki buffy kaplamaya en az 3 hacim (~ 3 mL) fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin. Hücreleri steril bir pipetle en az 3 kez yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyerek askıya alın.
8. 18−20 °C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin.
9. Hücre peletini 5 mL bazal ortam (Malzeme Tablosu) ile süspanse edin ve bir şişeye aktarın. Hücreleri bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C ve% 5 CO_2'de kültürleyin.

3. CIK indüksiyonu ve genişlemesi

1. 0. Günde, PBMC'leri (1 x 10⁶), 37 ° C ve% 5 CO_2'de nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 24 saat boyunca 1.000 IU / mL IFN-γ içeren taze bazal ortamda kültürleyin.
2. 1. Günde, ortamı 50 ng / mL anti-CD3 antikoru, 1 ng / mL rekombinant insan (rh) IL-1α ve 1.000 U / mL rh IL-2 içeren taze bazal ortam ile yenileyin. Ortamı her 3 günde bir yenileyin.
3. 7. Günde, ortamı 1.000 U / mL rh IL-2 içeren taze bazal ortam ile yenileyin. Hücre genişlemesinin sonuna kadar (14. gün) ortamı her 3 günde bir yenileyin.

4. CIK hücrelerinin değerlendirilmesi için immünofenotipleme

1. CIK hücrelerini 10 mL steril PBS ile yıkayın. 300 x g ve 18-20 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin, süpernatanı aspire edin ve hücreleri 10 mL PBS ile yeniden süspanse edin. Tripan mavisi dışlama testini kullanarak hücre sayısını sayın ve hücre canlılığını test edin.
2. CIK hücrelerini ~ 5-10 x 10⁵ hücre / mL PBS yoğunluğunda altı steril 1.5 mL tüpe ayırın. Aşağıdaki gibi etiketleyin ve tedavi edin: Tüp 1, Boş (antikor yok); Tüp 2, 20 μL izotip IgG1-FITC ekleyin; Tüp 3, 20 μL izotip IgG1-APC mAbs ekleyin; Tüp 4, 20 μL CD3-FITC ekleyin; Tüp 5, 20 μL CD56-APC mAbs ekleyin; ve Tüp 6, 20 μL CD3-FITC ve 20 μL CD56-APC mAbs ekleyin.
3. CIK hücrelerini 1 mL steril pipetle en az 3 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek antikorlarla nazikçe karıştırın ve ardından karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
4. Tüpleri 300 x g ve 18−20 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve hücre peletini 1 mL PBS ile bir kez askıya alın. 3 mL steril pipetle en az 1 kez yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin.
5. Adım 4.4'ü tekrarlayın.
6. Akış sitometrik analizinden önce tüpleri karanlıkta bırakın.

5. CD işaretleyici tanıma

1. Hücre süspansiyonunu, kapaktan nazikçe pipetleyerek bir hücre süzgeci kapağı (100 μm ağ) olan steril 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın. Tüpleri sırayla atlıkarınca üzerine koyun.
2. Akış sitometrisi analiz yazılımını açın ve deneysel bir klasör oluşturun. Deneye bir numune ve tüp eklemek için Yeni Numune düğmesine tıklayın ve tüpleri aşağıdaki gibi adlandırın: Tüp 1, Boş; Tüp 2, İzotip IgG1-CD3; Tüp 3, izotip IgG1-CD56; Tüp 4, CD3; Tüp 5, CD56; Tüp 6, CD3CD56.
3. CIK hücre popülasyonları için bir dağılım geçit sistemi oluşturun (Şekil 1A).
   1. Tüp 1'i (Boş) seçin ve bir FSC-A/SSC-A grafiği oluşturmak için Nokta Grafiği düğmesine tıklayın. Hücre kalıntılarını dışlamak için FSC-A eşiği >5 x 10⁴ ile tüm hücre popülasyonunun üzerine dikdörtgen bir kapı çizin.
   2. Yeni nokta çizimi için SSC-A/SSC-H parametresini seçin ve tüm tek hücrelerin etrafına bir çokgen kapısı çizin. Yeni histogram grafiği için sırasıyla Count/FITC (CD3) ve Count/APC (CD56) parametresini seçin. Yeni nokta grafiği için FITC (CD3)/APC (CD56) parametresini seçin ve dört alt popülasyonu tanımlamak için dört kadranlı bir geçit çizin.
   3. Her numunedeki 20.000 tek hücreden gelen verileri kaydedin. Önce Boş denetim örneğini analiz etmek için Örnek Yükle düğmesine tıklayın. CD56 ve CD3 kanal parametrelerini kullanarak tüm CIK hücre popülasyonunu tanımlayın.
4. Tüm örneklerin incelenmesi için adım 5.3'ü tekrarlayın.
5. CIK hücre popülasyonlarını analiz etmek için tek tek numunenin istatistiksel değerlerini içeren dosyaları açın ve bunları analiz dosyalarına yeniden yazdırın.

>6. İnsan kronik miyeloid lösemi K562 hücrelerinin ve yumurtalık kanseri OC-3 hücrelerinin kültürlenmesi ve boyanması

1. K562 hücreleri
   1. K562 hücrelerini tam ortamda (% 10 fetal sığır serumu [FBS] ve 50 U / mL antibiyotik içeren RPMI bazal ortamı ve glikozu 4.5 g / L'ye ayarlayın) 0.5−1 x 106 hücre / mL yoğunlukta bir hücre kültürü şişesinde kültürleyin ve 37 ° C ve% 5 CO_2'de nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.
   2. K562 hücrelerini içeren kültür ortamını 50 mL steril tüplere aktarın ve deney günü hücreleri 18-20 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'da pelet
   haline getirin.
   3. Süpernatanı aspire edin, hücreleri 5 mL steril PBS'de yeniden süspanse edin ve yavaşça iyice karıştırın.
   4. Hücreleri 10 dakika boyunca 300 x g'da pelet haline getirin. Süpernatanı aspire edin, hücreleri PBS'de yeniden süspanse edin ve K562 hücrelerini 0.5-1 x 10⁶ hücre / mL konsantrasyona ayarlayın.
   5. 5 μM'lik bir son konsantrasyonda 15 mL'lik steril bir tüpte 1 mL K562 hücre süspansiyonuna 0.5 μL karboksifloresein süksinimidil ester (CFSE) boyası ekleyin. Süspansiyonu en az 3 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırın.
   6. Tüpü 37 ° C ve% 5 CO_2'de 10-15 dakika boyunca bir hücre kültürü inkübatöründe bırakın.
   7. Tüpe 9 mL PBS ekleyin ve hücreleri 10 dakika boyunca 300 x g'da peletleyin. Süpernatanı boşaltın ve ardından hücre peletini 10 mL tam ortamda askıya alın. Hücre süspansiyonunu bir hücre kültürü şişesine aktarın ve inkübatöre yerleştirin.
2. OC-3 hücreleri
   1. OC-3 hücrelerinin tam ortamda (% 10 FBS ve 50 U / mL antibiyotik içeren DMEM / F12 ortamı) 0.5-1 x 10^{yoğunlukta 37} ° C'de ve% 5 CO_2'de bir hücre kültürü şişesinde 6 hücre kültürü.
   2. Kültür ortamını aspire edin ve deneyden 1 gün önce hücreleri PBS ile yıkayın.
   3. 1 mL hücre ayrışma enzim çözeltisi (Malzeme Tablosu) ekleyerek hücreleri ayırın ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
   4. 5 mL PBS ekleyerek hücreleri askıya alın ve hafifçe iyice karıştırın. Hücreleri 10 dakika boyunca 300 x g'da pelet haline getirin ve süpernatanı aspire edin. PBS'deki hücreleri yeniden süspanse edin ve hücreleri 0.5–1 x 10⁶ hücre / mL konsantrasyona ayarlayın.
   5. 5 μM'lik bir son konsantrasyonda 15 mL'lik steril bir tüpte 1 mL OC-3 hücre süspansiyonuna 0,5 μL CFSE boyası ekleyin. Süspansiyonu en az 3 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırın.
   6. Tüpü 37 ° C ve% 5 CO_2'de 10-15 dakika boyunca bir hücre kültürü inkübatöründe bırakın.
   7. Tüpe 9 mL PBS ekleyin ve hücreleri 10 dakika boyunca 300 x g'da peletleyin. Süpernatanı boşaltın ve ardından hücre peletini tam ortamla askıya alın. 5 x 10⁵ hücre / kuyuyu 6 oyuklu bir plakaya tohumlayın ve gece boyunca 37 ° C ve% 5 CO_2'de nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.

>7. Sitotoksik test

1. CIK ve K562 hücrelerinin kokültürü (CIK-K562)
   1. Adım 6.1.7'den itibaren K562 hücrelerini sayın ve tripan mavisi dışlama testi ile hücre canlılığını test edin. 5 x 10⁵ / mL yoğunlukta 6 oyuklu bir plakada her bir oyuklu her birine 1 mL K562 hücresi ekleyin.
   2. Adım 3.4'ten CIK hücreleri olan veya olmayan 1 mL bazal ortamı, adım 7.1.1'deki 6 oyuklu plakaya aşağıdaki gibi ekleyin: Kuyu 1 = Boş, tek başına K562 hücreleri (5 x 10⁵); Kuyu 2 = tek başına CFSE lekeli K562 hücreleri (5 x 10,⁵); Kuyu 3 = CIK hücreleri (E [efektör], 25 x 10⁵) + CFSE lekeli K562 hücreleri (T [hedef], 5 x 10⁵); Kuyu 4 = CIK hücreleri (E, 50 x 10⁵) + CFSE ile boyanmış K562 hücreleri (T, 5 x 10⁵).
   3. Hücre süspansiyonlarını en az 3 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Plakayı 24 saat inkübatöre yerleştirin.
2. CIK ve OC-3 hücrelerinin kokültürü (CIK-OC-3)
   1. Adım 3.4'ten CIK hücreli veya CIK hücresiz 1 mL bazal ortamı, adım 6.2.7'deki 6 oyuklu plakaya aşağıdaki gibi ekleyin: Kuyu 1 = Boş, tek başına OC-3 hücreleri (5 x 105); Kuyu 2 = Tek başına CFSE lekeli OC-3 hücreleri (5 x 10,⁵); Kuyu 3 = CIK hücreleri (E, 25 x 10⁵) + CFSE ile boyanmış OC-3 hücreleri (T, 5 x 10⁵); Kuyu 4 = CIK hücreleri (E, 50 x 10⁵) + CFSE ile boyanmış OC-3 hücreleri (T, 5 x 10⁵).
   2. Hücre süspansiyonlarını en az 3 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Plakayı 24 saat inkübatöre koyun.
3. 7-Aminoaktinomisin D (7-AAD) boya boyama
   1. CIK-K562 hücre süspansiyonunu adım 7.1.3'ten itibaren doğrudan 15 mL'lik steril bir tüpe koyun.
   2. Adım 7.2.2'den itibaren CIK-OC-3 gruplarından hem süspansiyonu hem de yapışkan hücreleri hasat edin.
      1. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik steril bir tüpe aktarın. İyiliği 1 mL steril PBS ile yıkayın, PBS'yi toplayın ve tüpe ekleyin. 0.5 mL hücre ayrışma enzimi çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
      2. Aynı tüpten 1 mL çözeltiyi ilgili kuyucuğa ekleyin ve hücreleri 1 mL steril pipetle en az 3 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırın. Tüm hücreleri aynı tüpte toplayın.
   3. 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı aspire edin ve hücreleri 1 mL steril PBS'de yeniden süspanse edin. Hücreleri 10 dakika boyunca 300 x g'da peletleyin, süpernatanı aspire edin ve hücreleri 100 μL steril PBS'de yeniden süspanse edin.
   4. Hücre süspansiyonuna 5 μL 7-AAD boya (50 ng/μL stok) ekleyin. Hücreleri 1 mL steril pipetle en az 3 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırın. 10 dakika inkübe edin ve analizden önce karanlıkta bırakın.
4. Sitolitik yetenek deneyi
   1. Adım 7.3.4'ten hücre süspansiyonunu karıştırın ve 5.1 ve 5.2 adımlarını bir kez tekrarlayın.
   2. Deneye bir örnek ve tüp eklemek için Yeni Örnek düğmesine tıklayın ve tüpleri aşağıdaki gibi adlandırın: Yalnızca Tüp 1, K562 (veya OC-3) hücreleri; Tüp 2, yalnızca CFSE lekeli K562 (veya OC-3) hücreleri; Tüp 3, E:T = 5:1; Tüp 4, E:T = 10:1.
   3. Sitolitik tahlil için bir Saçılma Geçit Sistemi oluşturun (Şekil 2A).
      1. Tüp 1'i seçin ve bir FSC-A/SSC-A grafiği oluşturmak için Nokta Grafiği düğmesine tıklayın. Hücre kalıntılarını dışlamak için FSC-A eşiği >5 x 10⁴ olan tüm olayların üzerine dikdörtgen bir geçit çizin.
      2. Yeni nokta grafiği için SSC-A/CFSE parametresini seçin. Yeni nokta grafiği için 7-AAD/CFSE parametresini seçin ve dört alt popülasyonu tanımlamak için dört kadranlı bir geçit çizin.
      3. Önce boş kontrol örneğini analiz etmek için Örnek Yükle düğmesine tıklayın.
      4. SSC-A ve FSC-A'nın voltajını ayarlayın. CFSE ve 7-AAD kanal parametrelerini kullanarak ölü hücre popülasyonunu tanımlayın. Her numunedeki >20.000 CFSE+ hücresinden gelen verileri kaydedin.
   4. Tüm örneklerin incelenmesi için bölüm 7.4.6'yı tekrarlayın.
   5. Canlı olmayan hücre popülasyonlarını analiz etmek için her bir örneğin istatistiksel değerlerini içeren dosyaları açın ve verileri analiz dosyalarına aktarın.

Sonuçlar

Şekil 1: Temsili bir PBMC örneğinden alınan CD3⁺CD56⁺ T hücrelerinin oranı. (A) Lenfositler belirli büyüklük ve taneciklik ile tanındı. Akış sitometrisi ile analiz için seçilen tek hücre popülasyonu. (B) Üç sağlıklı donörden alınan CIK genişleme etkinliğinin istatistiksel analizi t-testi kullanılarak yapıldı (*, p < 0.01).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
7-Amino Aktinomisin D	Bd	559925
APC Fare Anti-İnsan CD56 antikoru	Bd	555518	B159
APC Fare IgG1, κ İzotip Kontrolü	Bd	555751	MOPC-21
BD FACSCanto II Akış Sitometresi	Bd	338962		SN: R33896202856
Karboksifloresein diasetat süksinimidil ester (CFSE)	Bd	565082		CFSE boyasının (500 mg) 90 mL DMSO ile yeniden yapılandırılması
D-(+)-Glikoz çözeltisi	Sigma	G8644		K562 hücre kültürü için. 500 mL tam ortama 12,5 mL ekleyin
Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Eagle Medium/F12	HyClone (Klon	SH30023.02		OC-3 hücre kültürü için bazal ortam
Fetal sığır serumu	HyClone (Klon	SH30084.03		K562 ve OC-3 hücre kültürü için. Komple besiyeri, FBS'nin %10'unu içerir
Ficoll-Paque Artı	GE Sağlık Yaşam Bilimleri	71101700-EK		Yoğunluk gradyan çözümü
FITC Fare Anti-İnsan CD3 antikoru	Bd	555332	UCHT1
FITC Fare IgG1, κ İzotip Kontrolü	Bd	555748	MOPC-21
İnsan anti-CD3 mAb	Takara	T210	Tamam 3	50 mL İndüksiyon ortamına 2,5 mL stok (1 mg / 1 mL) ekleyin. -80 °C'de depolama stoğu
Penisilin-Streptomisin	Gibco (Gibco)	15140122		500 mL tam ortama 5 mL stok (10.000 U/mL) ekleyin. 4 °C'de depolama stoğu.
Prolökin	NOVARTIS FUARI			Proleukin Tozunun (22x106 IU) 1.2 mL steril su ile sulandırılması ve 50 mL İndüksiyon ortamına 2.7 mL eklenmesi. -20 °C'de depolama stoğu
Rekombinant İnsan İnterferon-gama	CellGenix	1425-050		rh IFN-g'nin (5x105 IU / 50 μg) 200 μL steril su ile sulandırılması ve 50 mL İndüksiyon ortamına 20 mL eklenmesi. -20 °C'de depolama stoğu
Rekombinant İnsan İnterlökin-1 alfa	PEPROTECH TEKNOLOJISI	200-01A		rh IL-1α'yı (10 μg) 1 mL steril su ile sulandırın ve 50 mL İndüksiyon ortamına 5 mL ekleyin. -20 °C'de depolama stoğu
RPMI1640 orta	Gibco (Gibco)	11875-085		K562 hücre kültürü için bazal ortam. 4 °C'de depolama stoğu
Sigma 3-18K Santrifüj	Sigma	10295
TrypLE Ekspres Enzimi	Gibco (Gibco)	12605028		Hücre ayrışma enzimi; Yapışan hücrelerin ayrılması için. Oda sıcaklığında saklama
X-VIVO 15 orta	Fransa	04-418Ç		PBMC ve CIK hücreleri için bazal ortam. 4 °C'de depolama

Serisi Serisi Serisi ) ) Serisi Serisi boy