$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Reaktif Hazırlama
- Tüm doku toplama için Kültür Ortamı stok solüsyonu hazırlayın: 1 L Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamı (DMEM), 110 mL Fetal Sığır Serumu (FBS), 11 mL Penisilin-Streptomisin (son konsantrasyon% 1) ve 1.1 mL filtreyle sterilize edilmiş insülin (son konsantrasyon% 0.1.) Stok çözeltisini 4 °C'de saklayın.
- Şelatlama Tamponu # 1'i hazırlayın: 30 mL Kültür Ortamı (1.1'de tarif edildiği gibi), 600 μL 0.5 M Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (son konsantrasyon 10 mM), 300 μL Gentamisin (son konsantrasyon %1) ve 60 μL Amfoterisin B (son konsantrasyon %0.2). Stok çözeltisini 4 °C'de saklayın.
- Şelatlama Tamponu #2'yi hazırlayın: 30 mL Kültür Ortamı (1.1'de tarif edildiği gibi), 300 μL 0.5 M EDTA (son konsantrasyon 5mM), 300 μL Gentamisin (son konsantrasyon %1) ve 60 μL Amfoterisin B (son konsantrasyon %0.2). Stok çözeltisini 4 °C'de saklayın.
- İnsan Minigut Ortamını Hazırlayın: 41.4 mL DMEM / F-12, 5 mL FBS (son% 10), 500 μL Penisilin-Streptomisin (son konsantrasyon% 1), 500 μL L-glutamin (son konsantrasyon% 1), 500 μL Gentamisin (son konsantrasyon% 1), 100 μL Amfoterisin B (son konsantrasyon% 0.2), 500 μL 1 M N-2-hidroksietilpiperazin-N-2-etan sülfonik asit (HEPES) (son konsantrasyon 10 mM), 500 μL 100x N-2 takviyesi ve 1 mL 50x B-27 takviyesi eksi toplam 50 mL hacim için A Vitamini. Stok çözeltisini -20 °C'de saklayın.
- İnsan Minigut Ortamını Tamamlayın: 10 mL İnsan Minigut Ortamı (1.4'te hazırlanmış), 10 μL 100 μg/mL Wnt3a (son konsantrasyon 100 ng/mL), 10 μL 100 μg/mL Noggin (son konsantrasyon 100 ng/mL), 10 μL 1 mg/mL R-Spondin (son konsantrasyon 1 μg/mL), 10 μL 500 μg/mL Epidermal Büyüme Faktörü (EGF) (son konsantrasyon 50 ng/mL), 10 μL 1 M N-Asetilsistein (son konsantrasyon 1 mM), 10 μL 10 mM Y-27632 (son konsantrasyon 10 μM), 10 μL 500 μM A-83 (son konsantrasyon 500 nM), 10 μL 10 mM SB202190 (son konsantrasyon 10 μM), 100 μL 1 M Nikotinamid (son konsantrasyon 10 mM) ve 1 μL 100 μM [leu] 15-gastrin 1 (son konsantrasyon 10 nM). Toplam hacim 10 mL. Stok çözeltisini 4 °C.
'de saklayın
not: Solüsyonlar 48 saat içinde kullanılmalıdır.
2. Tüm Dokudan Kript İzolasyonu ve Kaplaması
- Ameliyat odasında toplanma sırasında, insan ince bağırsak dokusu örneğini soğuk Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin'ine (DPBS) yerleştirin. Dışkı ve kandan temizlenene kadar numuneyi soğuk DPBS'de yıkayın. Numuneyi kript izolasyonu için hazır olana kadar RPMI 1640 Medium'da 4 °C'de saklayın.
not: Doku 24 saatten fazla saklanamaz.
- Numunenin dışkı ve kandan arınmış olduğundan emin olun. Hassas diseksiyon makası kullanarak, fazla yağı veya cerrahi klipsleri/zımbaları vb. çıkarın. Numuneyi tartın.
NOT: Yaklaşık 0.75-2.5 g'lık bir parça hedefleyin.
- Numuneyi 0,5 cm'lik parçalar halinde kesin ve 30 mL Şelatlama Tamponu #1'e yerleştirin (adım 1.2'de hazırlandığı gibi).
- Düşük hızda 15 °C'de 4 dakika çalkalayın.
- Dokuyu 100 μm hücre süzgecinden süzün ve akışı atın.
- Dokuyu 30 mL Şelatlama Tamponu #2'ye ekleyin (adım 1.3'te hazırlandığı gibi).
- Düşük hızda 15 °C'de 4 dakika çalkalayın.
- Dokuyu 100 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün ve akışı atın.
- Adım 2.8'de kullanmak için 500 mL bazal membran matrisini buz üzerinde çözdürün.
- 50 mL'lik konik bir tüpte 10 mL soğuk DMEM'e doku ekleyin ve 10 saniye boyunca elle kuvvetlice çalkalayın.
- 100 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün ve akışı toplayın (Etiket #1). Tüp #1'i buz üzerinde tutun.
- Ayrı bir 50 mL konik tüpte 10 mL soğuk DMEM'e doku ekleyin ve 10 saniye boyunca elle kuvvetlice çalkalayın.
- 100 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün ve akışı toplayın (etiket #2).
- Akışı olan dört konik tüp olana kadar iki kez daha tekrarlayın (etiketli tüpler # 1-4).
- Tüp #1 çözeltisini 100 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin ve akışı 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın (Etiket #1). #2-4 için tekrarlayın.
- 15 mL tüpleri #1-4'ü 200 x g'de 4 ° C'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin.
- Laminer akış başlığında, süpernatanı #1-4 numaralı tüplerden çıkarın ve atın. Topağın hemen üzerindeki doku bulutunu bozmaktan kaçının, bu geride bir süpernatant bırakmak anlamına gelse bile.
- Yavaşça pipetleyerek, peleti #1-4 tüplerinde kalan süpernatan ile karıştırın.
- Karışımı #1-4 tüplerinden tek bir 2 mL konik tüpe aktarın.
- Konik tüpü 200 x g'da 4 °C'de 20 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı çıkarın ve peleti 500 μL bazal membran matrisinde yeniden süspanse edin.
not: Bazal membran matrisini her zaman buz üzerinde tutun ve sonraki adımlar için hızlı bir şekilde çalışın. Bu ürün oda sıcaklığında çok hızlı bir şekilde polimerize olur.
- 24 oyuklu bir plakadaki bir kuyunun merkezine 50 μL numune / bazal membran matris süspansiyonu uygulayın. Bu kubbe şeklinde görünmelidir.
not: Soğutulmuş pipet uçlarının kullanılması, süspansiyonun daha düzgün aktarılmasına yardımcı olarak polimerizasyonu en aza indirir.
- Toplam 10 kuyuyu doldurmak için 9 kez tekrarlayın.
- Polimerizasyona izin vermek için 24 oyuklu plakayı 37 °C, %5 CO2 inkübatörüne 30 dakika boyunca yerleştirin.
- Her oyuğa 500 μL Human Minigut Media Complete (adım 1.5'te hazırlandığı gibi) ekleyin. Her 2 günde bir değiştirin.
- Tomurcuklanma görüldüğünde 5-10 gün sonra enteroidleri toplayın. Toplama talimatları için Adım 4 ve 5'e bakın.
3. Deneysel NEC'nin İndüksiyonu
- 0. Günde her bir oyukta 500 μL Human Minigut Media Complete'e (adım 1.5'te hazırlandığı gibi) 10 μL 5 mg / mL lipopolisakkarit (LPS) ekleyin. Toplanana kadar her 2 günde bir değiştirin.