Kanser Hücrelerinin Nötrofil Hücre Dışı Tuzaklara Yapışmasını Tespit Etmek için İn Vitro Yapışma Testi

Özet

Najmeh, S., et al. Basitleştirilmiş İnsan Nötrofil Hücre Dışı Tuzakları (NET'ler) İzolasyonu ve İşlenmesi. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu videoda, kanser hücrelerinin nötrofil hücre dışı tuzaklara (NET'ler) yapışmasını tespit etmek için floresan mikroskobu kullanan bir testi gösteriyoruz. Test kuyucuklarında, NET'lere yapışan floresan işaretli kanser hücrelerinin sayısında kayda değer bir artış olurken, DNaz ile muamele edilen kuyucuklar, NET'lere kanser hücresi yapışmasında azalma sergilemektedir.

Protokol

1. NET-Kanser Hücresi Statik Adezyon Testi

1. 96 oyuklu düz tabanlı bir plakaya kuyu başına önceden elde edilen NET stoğundan 100 μl ekleyin ve karanlıkta 4 °C'de kuyuların O/N kaplamasına izin verin.
2. 12 ila 20 saat sonra, mikroskop altında kuyucukların dibinde tek tip bir hücresiz NET tek tabakasının oluşumunu doğrulayın (Şekil 1). Bu noktada, alttaki NET tek tabakasını bozmamaya dikkat ederek, yapışmayan tüm malzemeleri kuyulardan nazikçe aspire edin.
3. Her oyuğa 100 μl% 1 Sığır Serum Albümini (BSA) bloke edici çözelti ekleyin ve RT'de 1 saat bekletin.
4. A549 kanser hücrelerini 2 ml% 0.25 Tripsin çözeltisi kullanarak bir T-75 şişesinden ayırın. Ayrıldıktan sonra, tripsinli hücrelere 10 ml A549 ortamı ekleyin ve 4 ° C'de 450 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. 100 μl ortam başına 2 x10⁴ kanser hücresi konsantrasyonu elde etmek için süpernatantı atın ve ortamdaki hücreleri yeniden süspanse edin.
   not: A549 hücreleri ayrı ayrı büyütüldü. Kısaca hücreler %10 FBS ve %1 Penisilin Streptomisin içeren DMEM F12 besiyerinde kültürlenerek muhafaza edildi ve 37 °C %5 CO_2'de inkübe edildi. % 70 - 80 hücre birleşmesine ulaşıldığında,% 0.25 Tripsin-EDTA kullanılarak ayrıldılar ve yukarıda açıklanan aynı ortamda yeniden süspanse edildiler.
5. Ortam ml başına 1 μl CFSE ekleyerek ve RT'de 10 dakika boyunca lekelenmeye bırakarak CFSE kullanarak kanser hücrelerini boyayın. Boyamadan sonra, 5 dakika boyunca 4 ° C'de 450 x g'da santrifüjleyin, ardından süpernatantı atın ve 100 μl ortam başına 2 x10⁴ kanser hücresi konsantrasyonu elde etmek için ilk ortam hacmindeki hücreleri yeniden süspanse edin.
6. 1 saatlik NET blokajından sonra, blokaj solüsyonunu nazikçe aspire edin ve NET tek tabakasının üzerine oyuk başına 100 μl'ye eşdeğer 2 x10⁴ kanser hücresi ekleyin ve 37 ° C'de% 5 CO_2'de 90 dakika boyunca yapışmasına izin verin. Hücreleri nazikçe aspire edin ve yapışmayan hücreleri yıkamak için her bir oyuğa 100 μl PBS ekleyin.
7. Bazı kuyucuklarda, NET'leri bozmak için yıkamadan önce 10 dakika boyunca kuyu başına 1000U DNAse I ekleyin. Bu negatif bir kontrol görevi görecektir. Diğer kuyularda, 10 dakika boyunca kuyu başına 100 μl steril su ekleyin, bu da araç kontrolü (VC) görevi görecektir.
   NOT: Örnek boyutunu artırmak için genellikle koşul başına 3 çoğaltma gerçekleştirilir.
8. Kuyucuklardaki tüm çözeltileri aspire edin ve atın, altta sadece NET'ler ve yapışkan kanser hücreleri bırakın. Yapışık kanser hücrelerini NETS'e sabitlemek için oyuk başına 100 μl %4 formaldehit çözeltisi ekleyin ve testi floresan mikroskobu altında okuyun (Şekil 1). Sonuçları çizin ve analiz edin (Şekil 2).

Sonuçlar

Şekil 1. NET Tek Katmanlı. NET'lerle kaplanmış 96 oyuklu plaka kuyularının ışık mikroskobu görüntüleri, (A) kuyu boyunca tek tip bir NET tek tabakası gösterirken, (B) kuyunun kesintiye uğramış bir NET tabakası ile yetersiz kaplanmasını göstermektedir. Ölçek çubukları 40 μm'yi temsil eder.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (PBS), Modifiye, kalsiyum klorür ve magnezyum klorür içermez	avrupa bizonu	311-425-CL
RPMI-1640 L-glutamin içeren Orta	avrupa bizonu	350-000-CL	% 3 RPMI çözeltisi, RPMI'nin% 3 Fetal Sığır serumu ile takviye edilmesiyle yapılır
BD Pharm Lyse Lysing tamponu	BD Biyolojik Bilimler	555899
DNAse1	Roche	11284932001
F12 DMEM (Türkçe	avrupa bizonu	319-075-CL
Fetal Sığır Serumu (FBS)	avrupa bizonu	080-150
Penisilin / Streptomisin	Gibco (Gibco)	15140-122
CFSE (Mali İşler T	Canlandırıcı	C1157
% 0.25 Tripsin-EDTA	Gibco (Gibco)	25200-056

) arası Serisi