Bakteriyel Hücre Boyaması ve İmmünolojik Çalışmalara Hazırlık

Özet

Kaynak: Yang, J. et al., Konak Hücrelere Bakteri Yapışmasının Otomatik, Yüksek Verimli Tespiti.J. Vis. Uzm. (2021)

Bu video, kırmızı floresan boya kullanılarak immünolojik çalışmalar için bakteri hücrelerinin boyanmasını ve hazırlanmasını göstermektedir. Lekeli bakteriler, enfeksiyonun çokluğunu temsil eden konak hücre enfeksiyonu için istenen bakteri konsantrasyonunu elde etmek için bir büyüme ortamında seyreltilir ve yeniden süspanse edilir.

Protokol

>1. Bakteri üremesi ve lekelenmesi

1. Tüm bakteri çalışmalarını Biyogüvenlik Kabini, Biyogüvenlik Seviye 2 laboratuvarında gerçekleştirir.
2. Pseudomonas aeruginosa (PAO1), Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Bacillus subtilis vb. dahil olmak üzere tüm bakteri kültürlerini donmuş gliserol stoğundan aşılayın ve bunları Triptik Soya Suyu (TSB, 3 mL) içinde büyütün
.
3. Ertesi gün, bir alt kültürü aşılamak için gece boyunca kültürün 1:100 oranında seyreltilmesini kullanın ve bunları üstel faza kadar 3 saat boyunca TSB'de (1 mL) büyütün, optik yoğunluğu, 600 nm'de OD'yi ölçün (OD₆₀₀) doğrulamak için. OD_600'ün 0.4-0.6 aralığında olduğundan emin olun.
4. Bakteri-konak yapışma testini gerçekleştirmeden önce, bakteri süspansiyonunun TSB-agar plakaları üzerine plaka seri seyreltmeleri, gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin ve daha sonra bakteri kolonisi oluşturan birimleri, koloni sayısından CFU'ları oluşturun. P. aeruginosa için, 1.0'lık bir OD₆₀₀, 2 x 10⁸ canlı bakteri hücresi/mL'ye karşılık gelir ve L. monocytogenes için, 1.0'lık bir OD₆₀₀, 9 x 10⁸ canlı bakteri hücresi/mL'ye karşılık gelir.
5. Bakteri kültürlerini oda sıcaklığında (RT) 2 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüjleme ile üstel fazda hasat edin, ardından 1x fosfat tamponlu salin (PBS 1 mL) kullanarak bir kez yıkayın. Bakteriyel peletleri 1 mL 1x PBS'de yeniden süspanse edin ve bakteri süspansiyonlarının OD_600'ünü ölçerek konsantrasyonları belirleyin. Örneğin, OD₆₀₀ 0.5 olan P. aeruginosa, 1 x 10⁸ bakteri hücresi / mL'lik bir konsantrasyonu temsil eder.
6. Bakteriyel süspansiyonu, karanlıkta hafifçe döndürerek RT'de 30 dakika boyunca yeşil veya kırmızı bir floresan boya kullanarak boyayın. Bunun için, boyayı 1 kat seyreltmek için 1 mL bakteri süspansiyonuna 500 kat konsantre stok boyama boyasından 2 μL ekleyin. Leke boyasını yıkamak için, lekeli bakterileri 13.000 x g'da 2 dakika santrifüjleyin ve peleti 1 mL 1x PBS'de üç kez yeniden süspanse edin.
   not: Deneyde floresan- (yeşil floresan proteini (GFP-), kırmızı floresan proteini (RFP-), mCherry-, vb.) etiketli bakteriler kullanılıyorsa, bu bakteri boyama adımını atlayın. Bu protokolde GFP etiketli P. aeruginosa ve kırmızı floresan boya ile boyanmış L. monocytogenes kullanıldı.
7. Lekeli bakteri hücrelerini veya GFP etiketli bakterileri 2 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüjleme ile toplayın. Taze F-12K ortamında (1 mL) yeniden süspanse edin ve her kültürün OD_600'ünü ölçün. Kültürleri, enfeksiyonun çokluğuna (MOI) ve konakçı hücre konsantrasyonuna bağlı olarak istenen konsantrasyonlara sırayla seyreltin. Bu deneyde kullanılan son hacim 500 μL.
   not: Örneğin, Tripan Mavisi boyama kullanılarak sayılan konak hücre konsantrasyonu 1 x 10⁵ hücre / mL ise, 100'lük bir MOI'de istenen bakteri hücresi konsantrasyonu 1 x 10⁷ hücre / mL olacaktır. 0.5 OD_600'de P. aeruginosa konsantrasyonu 1 x 10⁸ / mL'dir. İstenilen konsantrasyonu elde etmek için, P. aeruginosa kültürünü 10 kat seyreltin ve 450 μL taze F-12K ortamına 50 μL yeniden süspanse kültür ekleyin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
10 adet PBS	VWR (VWR)	45001-130
BactoView Canlı Kırmızı	Biyotyum	40101	Bakteri staning boyası
merkezkaç	Eppendorf Belediyesi	5810R
E. coli			Laboratuvar stoğu
F-12k orta	ATCC (Uzay Servisi)	302004	A549 hücre kültürü ortamı
Fetal sığır serumu	Corning	35-016-Özgeçmiş
L. monositogenler			NIST koleksiyonları
OD600 DiluFotometre	IMPLEN
P. aeruginosa			Dr. Lori Burrows laboratuvar stoğu
P. aeruginosa ΔpilA			Dr. Lori Burrows laboratuvar stoğu
S. agalactiae			NIST koleksiyonları
S. aureus (S. aureus)	BEI (Türkçe)	NR-46543
S. aureus ΔsaeR	BEI (Türkçe)	NR-48164
S. rubidaea			NIST koleksiyonları
Tipik soya suyu	Büyüme hücreleri	MBPE-4040