Vitronektinin Bakteri Yüzeylerine Bağlanmasının Flow Sitometri Kullanılarak Tespiti

Özet

Kaynak: Singh, B. ve ark., Vitronektinin Bakteriyel Yapışma ve Serum Direncindeki Rolünü İncelemek İçin Deneyler.J. Vis. Uzm.(2018)

Bu video, vitronektinin bakteriyel yüzey proteinleri ile etkileşiminin tespitini göstermektedir. Akış sitometrisi analizi, vitronektine bağlı floresan etiketli antikorların floresan sinyalini ölçer ve bakteri yüzeyindeki varlığını doğrular. Bu teknik, konak-patojen etkileşimleri ve potansiyel bakteriyel enfeksiyon tedavileri hakkında bilgi sağlar.

Protokol

>1. Vitronektin, Vn'nin Bakteriyel Yüzey Protein-Ligandı Olarak Analizi

1. Akış sitometrisi
   kullanılarak bakteri yüzeyinde Vn bağlanmasının tespiti not: Akış sitometrisinde, pozitif olayları geçmek için yan saçılma ve ileri saçılma kullandık. Vn, Haemophilus influenzae tip f ile etkileşimleri incelemek için Hif klinik izolatları (n=10) negatif kontrol olarak E. coli BL21 (DE3) ile birlikte seçildi (Şekil 1A).
   1. Kültür: 10 μg/mL nikotinamid, adenin, dinükleotid (NAD) ve hemin ile desteklenmiş beyin-kalp infüzyonu (BHI) ortamında 200 rpm'de çalkalanarak Hif klinik izolatları. E. coli'yi kültürlemek için Luria-Bertani ortamını kullanın. Hif'i orta log fazında hasat edin (Optik yoğunluk, OD₆₀₀ = 0.3) ve bakterileri fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.2 içinde yeniden süspanse edin,% 1 (a / h) sığır serum albümini (BSA) (bloke edici tampon; PBS-BSA) olarak adlandırılır. Süspansiyonu 10⁹ koloni oluşturan birime, CFU/mL'ye ayarlayın.
   2. 5 x 10⁶ CFU içeren alikotları 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüplere (12 x 75 mm²) aktarın ve 1 mL bloke edici tampon ekleyin. Bakterileri peletlemek için süspansiyonu oda sıcaklığında (RT) 3.500 × g'da 5 dakika santrifüjleyin, ardından peleti bozmadan süpernatanı çıkarmak için dikkatlice aspire edin.
   3. Bakteri peletlerini 250 nM Vn içeren 50 μL bloke edici tampon ile yeniden süspanse edin ve numuneleri çalkalamadan RT'de 1 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, bakterileri 5 dakika boyunca 3.500 x g'da santrifüjleme ile peletleyin, ardından peletleri PBS ve benzeri santrifüjleme adımlarını kullanarak üç kez yıkayın.
   4. Bakteri peletine, PBS-BSA'da 1:100 seyreltmede 50 μL birincil koyun anti-insan Vn poliklonal antikorları (pAbs) ekleyin. Süspansiyonu RT'de 1 saat inkübe edin, ardından bağlanmamış antikorları çıkarmak için bakterileri PBS ile üç kez yıkayın (adım 1.1.3'te açıklandığı gibi).
   5. Daha sonra, floresein izotiyosiyanat (FITC) konjuge eşek anti-koyun pAbs (1:100 seyreltme) içeren 50 μL PBS-BSA ekleyin ve karanlıkta 1 saat RT'de inkübe edin.
   6. Bakterileri yalnızca bloke edici tampon ile ve pAb'leri Vn olmadan inkübe ederek boş bir kontrol hazırlayın.
   7. Bakterileri 1 mL bloke edici tampon ile üç kez yıkayın ve süspansiyonu bölüm 1.1.2'de açıklandığı gibi santrifüjleme yoluyla peletleyin. Son olarak, bakteri peletini 300 μL PBS ile yeniden süspanse edin ve akış sitometrisi ile analiz edin.

Sonuçlar

Şekil 1: Haemophilus influenzae serotip f, yüzey eksprese edilen PH yoluyla Vn'yi bağlar.(A) Vn'nin Hif klinik izolatlarının hücrelerine bağlandığını gösteren akış sitometrisi sonuçları. Her klinik izolat (5 x 10,⁶ CFU) 250 nM insan Vn ile inkübe edildi. Bağlı ligand, koyun anti-Vn pAb'leri ve FITC konjuge eşek anti-koyun sekonder antikorları kulla...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüp	BD Şahin	60819-138	12 × 75 mm stili
Sığır Serum Albüminleri (BSA)	Sigma-Aldrich	A2058	Hücre kültürü için uygun
Akış sitometresi	BD Biyolojik Bilimler	651154	Araştırma uygulamaları için hücre analizi notu
İnsan plazmasından vitronektin (Vn)	Sigma-Aldrich	V8379-50UG	Hücre kültürü sınıfı
E. coli konakçısı (E. coli BL21)	Yenilikçi	69450-3	Protein ekspresyon konağı
FITC konjuge eşek anti-koyun antikorları	AbD Serotec	STAR88F	Poliklonal
Koyun anti-insan Vn antikorları	AbD Serotec	AHP396	Poliklonal

Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi