Stromal Sitokin ile İndüklenen Hücre İçi Protein Fosforilasyonunun Fosfo-Flow Sitometri Kullanılarak Değerlendirilmesi

Özet

Kaynak: Coats, J. S., et al. Sitokin ile Transdüksiyonlu Stromal Hücre Hattı ile Enjeksiyon Yoluyla Hasta Kaynaklı Ksenogreftlerde Eksojen Sitokin Ekspresyonu. J. Vis. Uzm. (123) (2017).

Bu video, lösemi hücrelerinde proteinlerin stromal sitokin kaynaklı hücre içi fosforilasyonunun değerlendirmesini göstermektedir. Bu hücre içi fosforile proteinler, fosfo-akış sitometrisi tekniği kullanılarak ölçülür.

Protokol

1. Stroma Tarafından Üretilen Sitokin Aktivitesini Değerlendirmek için Fosfo-Flow Sitometri Deneyleri

NOT: Bireysel deney için stroma tarafından üretilen sitokinin ilgili biyo-aktivitesini doğrulamak için ilk deneyden önce tasarlanmış stromadaki süpernatanı değerlendirin. Tasarlanmış stroma doğrulandıktan sonra, yeni bir vektörle üretilen stroma tanıtılmadıkça daha fazla test gerekli değildir.

1. Uygun aşağı akış fosforilasyon hedeflerini tespit etmek için MUTZ5 ve/veya MHH-CALL4 lösemi hücre hatları (TSLP duyarlı), rekombinant insan sitokini ve fosfo-akış sitometrisi testlerinde kullanım için onaylanmış antikorları satın alın.
2. Kontrol ve sitokin eksprese eden stroma'dan hasat edilen süpernatanı çözdürün.
3. Lösemi hücre hatlarını R20 ortamında (Malzeme Tablosuna bakınız) 96 oyuklu bir doku kültürü plakasında oyuk başına 0.2 x^{10 6} hücre konsantrasyonunda kaplayın. Üçlü tahlillere izin vermek için koşul başına 3 kuyu plakası. 37 °C'de 2 saat inkübe edin. Bu süre, önceki kültür koşulları sırasında meydana gelen herhangi bir fosforilasyonun kaybına izin verir.
   NOT: Hücre hattı başına 12 kuyucuk, adım 1.4'te gösterilen her deneysel koşul için üçlü tahliller sağlar.
4. Kültürde 2 saat sonra, hücreleri her bir oyuktan ayrı 4 mL tüplere aktarın ve 500 x g'da 5 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüjleyin.
   1. Aşağıdaki deneysel koşulların her biri için hücreleri 200 μL'de yeniden süspanse edin (üç kopya halinde tahliller gerçekleştirin): 1) yalnızca negatif kontrol ortamı, 2) doyma konsantrasyonlarında (s) rekombinant sitokin ile pozitif kontrol ortamı (15 ng / mL'de TSLP, vb.), 3) kontrol stromasından stroma-süpernatan kontrol ve 4) sitokin üreten stromadan sitokin-stroma-süpernatant.
5. Hücreleri spesifik ticari fosfo-tahlil ile belirtilen süre boyunca inkübe edin (ör. TSLP'ye yanıt olarak MUTZ5 veya MHH-CALL4'te fosfo-STAT5 için 30 dakika).
6. 500 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı boşaltın.
7. Üreticinin protokolüne göre fosfo-akış sitometrisi boyama yapın ve akış sitometrisi verilerini toplayın.
8. Akış sitometrisi verilerini analiz edin.
   1. İleri (FSC, hücre boyutunu gösterir) ve yan (SSC, hücre tanecikliğini gösterir) ışık saçılımına dayalı olarak sağlam hücrelere geçit verin.
   2. Her numunedeki sağlam hücrelerin medyan floresan yoğunluğunu (MFI) belirleyin. Stromal hücre süpernatantının üçlü değerlerinden elde edilen ortalama MFI'yi pozitif ve negatif ortam kontrollerininkiyle karşılaştırın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
10 mL serolojik pipetler	doğan	357551
15 mL polipropilen konik borular	balıkçı	05-539-12
50 mL polipropilen konik borular	doğan	352098
1 mL pipet uçları	balıkçı	2707509
200 μL pipet ucu	Denville Bilimsel	P3020-CPS
10 μL pipet uçları	Denville Bilimsel	P-1096-CP
"R20" hücre kültürü ortamı, toplam hacmin% 'si (195 mL yapar)			Laboratuvar Tarifi
RPMI, %76,84 (150 mL)	Medya Teknolojisi	10-040-Özgeçmiş
FBS, %20,49 (40 mL)	Medya Teknolojisi	35-011-Özgeçmiş
2mM L-glutamin, %1.02 (2 mL)	Medya Teknolojisi	35-011-Özgeçmiş
1 mM Na piruvat,% 1.02 (2 mL)
Penisilin-Streptomisin, %0.51 (1 mL	Medya Teknolojisi	30-002-CL
2-Merkaptoetanol, %0,10 (0,1 M), %0,10 (200 μL)	Mp	190242
Biyoloji
"CALL-4" MHH-CALL-4 hücre hattı, insan B hücresi öncüsü lösemi	DSMZ (Türkçe)	ACC 337
MUTZ-5 hücre hattı, insan B hücresi öncüsü lösemi	DSMZ (Türkçe)	ACC 490
Rekombinant İnsan TSLP proteini	Ar-Ge Sistemleri	1398-TS-010
Flow sitometri antikorları (klon)*
Anti-fare CD45 FITC (30F11)	Miltenyi Biyotec	130-102-778
CD127 PE (MB15-18C9) (alternatif adı IL-7Rα'dır)	Miltenyi Biyotec	130-098-094
CD34 APC (8G12)	BD Biyolojik Bilimler	340667
CD45 PE-CY7 (HI30)	eBiyobilim	25-0459
"FVD" Sabitlenebilir canlılık boyası eFluor 780	eBiyobilim	65-0865
Ig κ hafif zincir FITC (G20-193)	BD Pharmingen	555791
Ig λ hafif zincir FITC (JDC-12)	BD Pharmingen	561379
IgD PE (IA6-2)	Biyo Efsane	348203
IgM PE-CY5 (G20-127)	BD Biyolojik Bilimler	551079
pSTAT5 PE, fare anti-STAT5 (pY694)	BD Fosfo Akışı	612567
Diğer malzemeler ve ekipmanlar
FlowJo akış sitometrisi analiz yazılımı	Akış Jo, LLC	Versiyon 10
* Aksi belirtilmedikçe tüm antikorlar insan karşıtıdır.

Serisi Serisi Dersi Dersi