$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Fiksasyon ve Parafin Gömme için Doku Hazırlama
NOT: Tekrarlayan üriner sistem enfeksiyonunun (rİYE) ileri düzey yönetimi için trigonitin elektro-fulgurasyonu ile sistoskopi yapılan rıza gösteren kadınlardan biyopsiler alındı. rİYE, 12 ayda 3 İYE olarak tanımlanır. Biyopsi alınması, hasta anestezi altındayken, bilgilendirilmiş hasta onamı alındıktan sonra ameliyathanede yapıldı. Tüm örnekler deneyden önce kodlandı ve tanımlanmadı.
- Fleksibl sistoskop ile ürolojik forseps ile mesane trigonesinden soğuk kap (~ 1 mm3) biyopsi alın ve hemen 1x steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde hazırlanmış 1.5 mL %4 v/v paraformaldehit (PFA) içeren steril 2 mL kriyoviyal içine yerleştirin.
NOT: 1x PBS'de %4 PFA önceden yapılabilir ve ihtiyaç duyulana kadar -20 °C'de saklanabilir.
- Biyopsiyi oda sıcaklığında 6 saat veya 4 ° C'de 16-24 saat sabitleyin.
NOT: Fiksasyon süresi doku örneğinin boyutuna göre hesaplanmalı ve aşırı fiksasyondan kaçınılmalıdır. Otofloresan getirdiği için glutaraldehitin fiksatif olarak kullanılması tavsiye edilmez.
- Sterilize edilmiş bir başlık veya biyogüvenlik kabininde, sabitleyiciyi pipetleyerek çıkarın ve 1,5 mL steril 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile değiştirin. Numuneleri gece boyunca 4 °C'de tutun veya hemen doku işleme ve parafin gömme işlemi gerçekleştirin.
- Doku bloklarını 5 μm kalınlığında kesitlere ayırmak için sterilize edilmiş bir mikrotom kullanın ve parafin doku kesitlerini yüklü cam mikroskop slaytlarına yapıştırın. 16S ribozomal RNA (16S rRNA) floresan in situ hibridizasyon (FISH) protokolü için biyopsi başına en az iki slayt gerekecektir.
NOT: Biyopsi dokusu, tüm bölümlerdeki ürotelyal tabakaların görüntülenmesini sağlamak için kesme düzlemine göre kesitsel olarak düzenlenmelidir. Kesit kalınlığının bakteri topluluğu tespiti için optimize edilmesi gerektiğine de dikkat edilmelidir. Dokuda yerleşik bakterilerin son derece kıt olduğu enfeksiyonlarda daha ince bölümler veya çoklu seri bölümlerin örneklenmesi gerekebilir (ör., 1.000 memeli hücresi başına <1 dokuda yerleşik bakteri).
2. Evrensel 16S rRNA Probları ile Floresan Yerinde Hibridizasyon
NOT: Biyopsi başına iki slayt gereklidir. Evrensel 16S rRNA probu için bir slayt ve şifreli bir diziye sahip bir kontrol probu için bir slayt gereklidir. Bu, mikroskopi sırasında gerçek sinyali arka plan sinyalinden ayırt etmek için önemlidir, çünkü mesane epiteli birden fazla kanalda otomatik floresan olur. Karıştırma probuna ek olarak, montajdan önce %0.1 Sudan Black B ile bloklama, dokuda bulunan arka plan otofloresansını azaltabilir.
- Reaktiflerin ve çeker ocakların hazırlanması
- Boş bir çeker ocak (veya uygun şekilde takılmış biyogüvenlik kabini) %70 etanol ile temizleyin.
- 10 mL steril filtrelenmiş su içinde 0.9 M sodyum klorür (NaCl), 20 mM Tris (hidroksimetil) aminometan-hidroklorür (Tris-HCl, pH 7.2),% 0.1 sodyum dodesil sülfat (SDS) içeren hibridizasyon tamponunu hazırlayın.
NOT: Steril filtrelenmiş su, otoklavlanmış damıtılmış suyun 0,22 μM'lik bir filtreden geçirilmesiyle hazırlanabilir. Hibridizasyon tamponu oda sıcaklığında saklanabilir, ancak SDS çözeltiden çökelebilir. SDS çökelirse, kullanmadan önce çözeltiyi 50 ° C'lik bir su banyosunda ısıtın.
- Yıkanmış, otoklavlanmış şişelerde steril filtrelenmiş suda en az 100 mL %95 ve %90 etanol hazırlayın.
- Floresan etiketli liyofilize probları, filtreyle sterilize edilmiş nükleaz içermeyen suda hazırlanan 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) ve 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) tamponunda (TE) 100 μM'lik bir nihai konsantrasyona kadar çözün. Bu protokolde kullanmak için TE tamponunda 1 μM'lik bir seyreltme hazırlayın. Hem 100 μM konsantre stoğu hem de 1 μM stoku sulandırılmış probları -20 °C'de ışıktan koruyarak saklayın.
NOT: Floresan etiketli probları suda çözmeyin. Floroforu nükleotid probuna konjuge eden N-hidroksisüksinamid (NHS) ester bağının hidrolizini önlemek için tamponlama gereklidir.
- Beş Coplin kavanozunu %70 etanol (EtOH) ile temizleyin, kurumasını bekleyin, şu şekilde etiketleyin: ksilenler I, ksilenler II, %95 EtOH, %90 EtOH, çift damıtılmış su (ddH2O) ve 100 mL uygun çözelti ile doldurun. Bu, sonraki adımlarda karışıklığı önlemeye yardımcı olacaktır.
- Doku de-parafinizasyonu ve rehidrasyonu
- Kaputta, biyopsi başına iki slaytı dikey bir sürgülü rafa yerleştirin.
- Ksilenler I Coplin kavanozuna (100 mL ksilen içeren) 10 dakika boyunca dikey bir kaydırma rafı yerleştirin.
- Sürgülü rafı ksilenler I'den çıkarın ve fazla ksilenleri çıkarmak için altını bir kağıt havlu üzerine kurulayın. 10 dk.
boyunca ksilenler II Coplin kavanozuna yerleştirin
NOT: Sertifikalı bir çeker ocak dışında asla ksilenler ile çalışmayın.
- Deparafininize doku kesitlerini sırasıyla etiketli Coplin kavanozlarında her biri 10 dakika boyunca ardışık etanol yıkamalarında (% 95 ve% 90) rehidrat edin.
NOT: Bu aşamada, Hibridizasyon Tamponunu bir su banyosunda 50-56 °C'ye ısıtın.
- Sürgülü rafı %90 etanol yıkamadan çıkarın, fazla etanolü çıkarmak için altını kağıt havluların üzerine kurulayın ve 100 mL filtreyle sterilize edilmiş ddH2O içeren ddH2O Coplin kavanozuna 10 dakika boyunca yerleştirin.
- ddH2O yıkamasını beklerken, boyama çözeltisini oluşturmak için probları bir hibridizasyon tamponunda 10 nM'ye seyreltin. Slayt başına 150 μL boyama çözeltisi hazırlayın.
NOT: Tüpleri alüminyum folyoya sararak ve bir çekmecede saklayarak lekeleme solüsyonunu ışıktan koruyun. Tezgah üzerinde floresan etiketli problarla çalışırken, mümkün olduğunda tepe ışıklarını kapatmayı düşünün. Hibridizasyon tamponunda seyreltilen problar tekrar kullanılmamalıdır.
- Hibridizasyon ve karşı boyama
- Bir P1000 uç kutusunun haznesine ıslatılmış, buruşturulmuş Kimwipe ve steril su koyarak her prob için bir nemlendirme odası hazırlayın. Uç tutucu kartuşu üstüne yerleştirin - kızakların oturacağı yer burasıdır.
NOT: Hibridizasyon sırasında biyopsi bölümlerinin kurumasını önlemek için bir nemlendirme odası kullanılması önemlidir. Ticari olarak temin edilebilen nemlendirici odalarının stabil ve nemli bir atmosfer sağlamak için tasarlandığına dikkat edilmelidir. Bununla birlikte, burada ayrıntılı olarak açıklanan teknik, nemi önemli ölçüde daha az maliyetle yeterince kontrol eder.
- Slaytları sürgülü raftan çıkarın ve yeni bir kağıt havlu üzerine (kağıt mendil tarafı yukarı bakacak şekilde) yerleştirin. Slaytı kurutmak için bir Kimwipe kullanın. Suyu uzaklaştırmak için biyopsi bölümünün yakınına (üzerine değil) hafifçe vurmaya dikkat edin. Hidrofobik bir kalem kullanarak, biyopsi bölümünün etrafına bir kenarlık çizin ve kayar dokuyu nemlendirme odasına yukarı bakacak şekilde yerleştirin.
NOT: Hibridizasyondan önce dokuların kurumaması için hızlı çalışın.
- Nemlendirme odasını 50 °C'ye ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin. 50-150 μL boyama solüsyonunu doğrudan dokunun üzerine pipetleyin, böylece doku etrafındaki hidrofobik sınır tarafından yapılan dikdörtgen doldurulur. Hidrofobik sınırı aşmak için çok fazla çözelti eklememeye dikkat edin. Kutuyu yavaşça kapatın.
- Gece boyunca (~ 16 saat) karanlıkta 50 ° C'de inkübe edin. Kuluçka makinesinin bir penceresi varsa, karanlık bir ortam yaratmak için alüminyum folyo ile örtün.
NOT: Güvenilir bir sinyal için FISH probunun erime sıcaklığının altında bir hibridizasyon sıcaklığı gereklidir. 50 °C, evrensel 16S rRNA probu için en uygun sıcaklıktır ancak diğer problar için optimal olmayabilir.
- Ertesi sabah, ddH2O'da 0,9 M sodyum klorür (NaCl) ve 20 mM Tris-HCl (pH 7,2) içeren en az 500 mL Yıkama tamponu hazırlayın ve vakumlu şişe üstü filtreli steril bir şişeye filtreyle sterilize edin. Bir su banyosunda 50-56 ° C'ye ısıtın.
- Slaytları nemlendirme odalarından çıkarın ve kalan hibridizasyon solüsyonunu bir Kimwipe ile dikkatlice uzaklaştırın. Slaytları dikey bir boyama rafına yerleştirin.
- Boyama rafını, 10 dakika boyunca 100 mL önceden ısıtılmış Yıkama tamponu içeren opak bir Coplin kavanozuna yerleştirin. Coplin kavanozları opak değilse (örneğin cam), inkübasyon adımları sırasında karanlıkta bırakın - belki bir kutunun altına veya bir çekmeceye.
- Yeni Coplin kavanozlarında taze Yıkama tamponu ile yıkama adımını iki kez tekrarlayın.
- Yıkama adımları sırasında, yıkama tamponunda 100 μg/mL Hoechst 33342 1:1.000 stok çözeltisini seyrelterek karşı lekeyi hazırlayın. Aynı tüpe, Alexa-555 buğday tohumu aglütinini (WGA) 5μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona ve Alexa-555 Phalloidin'i 33 nM'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. Kullanıma hazır olana kadar karanlıkta saklayın.
NOT: Hoechst, Alexa-555 WGA ve Alexa-555 Phalloidin, sırasıyla deoksiribonükleik asit (DNA), müsin/üroplakinler ve aktini etiketler ve üreticinin talimatlarına göre karanlıkta uzun süre saklanabilir. Problar ve karşı boyalar için kullanılan floresan etiketler, kullanılacak mikroskop için mevcut filtre setleri için özelleştirilebilir.
- Slaytları son yıkamadan çıkarın ve fazla yıkama tamponunu bir Kimwipe ile nazikçe fitilleyin. Slaytları doku tarafı yukarı bakacak şekilde bir kağıt havlu üzerine yerleştirin ve hidrofobik sınırın dolması, ancak taşmaması için doğrudan dokunun üzerine 50-150 μL karşı leke ekleyin. Bir kriyo kutusu üstü ile dört slayta kadar örtün ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
- Kenarları tekrar boyama rafına yerleştirin ve her biri 10 dakika boyunca taze Yıkama tamponu ile Coplin kavanozlarında iki kez daha yıkayın.
- Son yıkamadan sonra slaytları iyice kurulayın ve mendil tarafı yukarı bakacak şekilde bir kriyo kutusunun altındaki bir kağıt havlunun üzerine yerleştirin. Bir damla montaj ortamını doğrudan dokunun üzerine sıkın. Nazikçe uygun boyutta bir lamel (biyopsi boyutuna bağlı olacaktır) üstüne yerleştirin. Görüntülemeyi engelleyecekleri ve kapakla kayan slaytların karanlıkta gece boyunca kürlenmesine izin verecekleri için baloncukları nazikçe bastırın.
- Ertesi gün, lamellerin kenarlarını hafif bir kat şeffaf oje ile slayta kapatın. Karanlıkta 10 dakika kurumaya bırakın ve ardından konfokal mikroskopi için karanlıkta 4 °C'de saklayın.
3. 16S rRNA FISH'in Konfokal Mikroskopi ile Görselleştirilmesi
>NOT: Bu protokol için en iyi sonuçlar, 63x ve 100x objektifli lazer taramalı konfokal mikroskop ile elde edilir. Hoechst, Alexa-488 ve Alexa-555 floresansının görselleştirilmesi için uygun filtre setleri gereklidir. Bununla birlikte, konfokal bir mikroskop mevcut değilse standart floresan mikroskobu kullanılabilir. Bu protokol bir lazer taramalı konfokal mikroskop içindir.
- Konfokal mikroskobu ve mikroskopla ilişkili bilgisayar yazılımını üreticinin talimatlarına göre açın.
- Slaytı yükleyin ve mavi (Hoechst) kanalındaki 10x objektif ile görselleştirin. Çekirdekler görünene kadar dikkatlice odaklanın.
- Odaklandıktan sonra hedefi yüksek büyütme (63x veya 100x) olarak değiştirin. Lamelin üzerine yağ ekleyin. Odaklama sırasında objektif merceğinin yağla temas ettiğinden emin olarak yeni objektifle yeniden netleme yapın.
NOT: Yalnızca yüksek büyütme oranlarında (63x veya 100x) ince odaklama kullanın. Yağ sadece bir yağ hedefi için kullanılmalıdır.
- Hangi slaytların FISH pozitif ve hangilerinin FISH negatif olduğunu belirlemek için yeşil (geliştirilmiş yeşil floresan proteini, eGFP/Alexa-488) kanalındaki göz merceğinden geçen her slaytı hızlı bir şekilde değerlendirin.
NOT: Deneysel yanlılığı azaltmak için bu ilk değerlendirmenin/puanlamanın ayrı bir kişi tarafından kör olarak yapılması en iyisidir.
- Lekeli biyopsileri görüntülemek için, FISH pozitif bir slayt ile başlayın ve bilgisayar görselleştirme moduna geçin. 405 (Hoechst), 488 (Alexa-488) ve 555 (Alexa-555) kanallarını seçin. İğne deliğini en uzun dalga boyu kanalını, bu durumda 555'i kullanarak ayarlayın. 488 kanalındaki etiketli bakterilerin görselleştirilmesi için doğru odak düzlemini bulun. Odak düzlemini değiştirmeden, her kanal için kazancı, lazer gücünü ve ofseti, sinyal doygun olmayacak ve arka plan aşırı düzeltilmeyecek şekilde ayarlayın. Görüntüyü her üç kanalda da elde edin.
NOT: Bir deneydeki her slaydı görüntülemek için 488 kanalı için aynı ayarları kullanın. Bakteriyel görselleştirme için en uygun odak düzlemi alanlar arasında değişirse, lazer gücünün 405 ve 555 kanallarında ayarlanması gerekebilir.