1. Jurkat T hücre hattının hazırlanması (2. Gün)
NOT: Tüm prosedürler sınıf II biyolojik güvenlik kabininde yapılmalıdır.
- 24 mL bazal hücre kültürü ortamında Jurkat T hücrelerini kültürleyin +% 10 FBS +% 5 penisilin / streptomisin 37 ° C'de +% 5 CO2 (Malzeme Tablosu). Jurkat T hücreleri, her 3 günde bir önceden ısıtılmış kültür ortamına 1: 6-1: 8 geçirilerek korunabilen bir süspansiyon hücre hattıdır. Sallamayın.
- Apoptotik hücreleri hazırlamak için, bunları her şişede% 90 birleşim noktasına kadar büyütün (geçtikten sonra elde edilmesi 3-4 gün sürer). Bu çalışma için, bu protokolde kullanılan yeterli sayıda hücre elde etmek için beş T75 şişesinden hücreler kullanın.
not: Birleşen bir şişe yaklaşık 20-24 milyon hücre içerir.
- Her şişeden (yaklaşık 24 mL) hücreleri (şişenin tamamı) pipetleyin ve hücreleri serolojik bir pipet kullanarak steril 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Birden fazla şişe için birden fazla konik boru kullanın.
- 50 mL'lik konik tüpten 11 μL'lik bir hücre alikotunu çıkararak hücreleri sayın ve 11 μL tripan mavisi lekesi ile karıştırın ve 11 μL'yi hemositometre slaytlarına pipetleyin.
- Slaytı otomatik bir hücre sayacına yerleştirin ve her bir şişe 24 mL ortam içerdiğinden, canlı hücre sayısını 24 ile çarparak her şişedeki toplam hücre sayısını hesaplamak için canlı hücre sayısını kaydedin.
- Hücre süspansiyonunu 271 x g'da oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca pelet hücrelerine santrifüjleyin.
- Süpernatanı aspirasyon ile atın ve mL başına 3.0 x 106 hücre elde etmek için hücre peletini ortamda yeniden süspanse edin.
- 100 mm x 20 mm'lik doku kültürü kaplarında 5 mL hücre bulundurun (yaklaşık dokuz tabak kullanılacaktır; her tabaktaki toplam hücre miktarı ~ 15 x 106 olmalıdır).
- Kontrol/maruz kalmamış bir tabak kullanın ve kalan tabaklar UV'ye maruz kalacaktır.
- UV çapraz bağlayıcıyı doğru enerji seviyesine ayarlayın, enerji düğmesine basın ve makinenin 600 μJ/cm2 x 100.
olarak okuyacağı sayısal tuş takımını kullanarak "100" girin
not: UV çapraz bağlayıcı enerji birimleri μJ/cm2 x 100 cinsindendir; bu nedenle, 60 milijoule/cm2 elde etmek için birimleri UV çapraz bağlayıcıya uyacak şekilde dönüştürün.
- UV çapraz bağlayıcıyı kullanarak kontrol dahil olmak üzere tüm bulaşıkları hücrelerle 60 milijoule (mJ) /cm2'de ışınlayın. UV ışığı plastik kapağa nüfuz etmeyeceğinden, UV'ye maruz kalma sırasında doku kültürü kaplarının üst kapağını çıkarın.
- Tüm bulaşıkları, maruz kalmayan kontrol de dahil olmak üzere bir hücre kültürü inkübatöründe, 37 ° C'de% 5 CO2'de 4 saat boyunca inkübe edin.
- Üreticinin talimatlarına göre, 4 saatlik inkübasyondan sonra annexin V ve propidium iyodür (PI) (sırasıyla apoptoz ve nekroz belirteçleri) içeren bir apoptoz tahlil tespit kiti kullanarak akış sitometrisi ile apoptozu onaylayın.
not: 4 saatlik bir inkübasyonu takiben UV çapraz bağlayıcıda 600 μJ /cm2 enerji seviyesinde Jurkat T hücrelerinin ışınlanması, apoptotik (hem erken hem de geç) hücrelerin %≥75'inin geç apoptotik fenotipten daha erken apoptotik fenotipe sahip olmasına yol açacaktır. Bu, alveolar makrofajların onları tanımasını ve geç apoptotik hücrelerin aksine, zarları bozulmadan olduğu için onları yutmasını kolaylaştırır ve bu çalışmada daha yüksek bir efferositik indekse ve alveolar makrofaj efferositozunun daha doğru görüntülenmesine yol açar.
- Kompanzasyon analiz tüpleri için kullanmak üzere birkaç tabaktan (hem "UV yok" hem de "UV'ye maruz kalan") 333 μL (1 x 106 hücreli) Jurkat T hücrelerini bir araya getirin.
- Boyanmamış, annexin V tek boyalı, PI tek boyalı, UV kontrolü olmayan ve 600 μJ/cm2 UV'ye maruz kalmış etiketli akış sitometri tüplerinde 333 μL Jurkat T hücresi alikot.
- Tüpleri RT'de 5 dakika boyunca 188 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı boşaltın.
- Hücreleri 500 μL soğuk, 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden süspanse ederek yıkayın.
- RT'de 5 dakika boyunca 188 x g'da santrifüj ve pelet hücreleri. Santrifüjlemeden sonra süpernatanı atın.
- Hücreler santrifüjlenirken 10x bağlama tamponunu damıtılmış su ile seyrelterek akış tüpü başına 400 μL 1x bağlama tamponu hazırlayın.
- Üreticinin talimatlarına göre ek V ve PI inkübasyon reaktifini (numune/tüp başına 100 μL) hazırlayın.
- Santrifüjlemeden sonra süpernatanı boşaltın ve tüm tüpleri 400 μL 1x bağlayıcı tampon içinde nazikçe yeniden süspanse edin, ardından her numune tüpüne 100 μL annexin V inkübasyon reaktifi ekleyin. Son olarak, ilgili tüplerine 100 μL annexin V tek leke ve PI tek leke ekleyin, ancak lekelenmemiş tüpe 1x bağlayıcı tamponun ötesinde bir şey eklemeyin.
- Tüpleri karanlıkta RT'de 15 dakika inkübe edin.
- Tüm hücreleri RT'de 5 dakika boyunca 188 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı boşaltın.
- Hücreleri 400 μL 1x bağlayıcı tamponda yeniden süspanse edin, ardından akış sitometrisi ile numuneleri apoptoz açısından analiz edin. Boyamanın doğru temsilini sağlamak için tüp başına en az 10.000 olay toplayın.
- Bulaşıklardan alınan tüm ışınlanmış hücreleri 50 mL'lik bir konik tüpe ve RT'de 5 dakika boyunca 271 x g'da santrifüjleme ile pelet hücrelerine birleştirin.
- Süpernatanı tüpten aspirasyon ile atın ve 24 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) ve pelet hücrelerindeki hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 271 x g'da santrifüjleme ile yeniden süspanse edin.
- Süpernatanı aspirasyon ile tüpten atın ve IACUC tarafından onaylanan fareleri dozlamak için kullanılan PBS miktarında hücreleri yeniden süspanse edin. Kullanılan doz fare başına 5-10 x 106 hücre / 50 μL arasındadır; bu nedenle, 10 fare için 500 μL'de yeniden süspanse edin (her dozdaki hücre sayısı, ışınlama için kaç hücrenin kültürlendiğine bağlı olarak değişir).
not: Pipet ucunun kenarlarına yapışabilecek ve hücre kaybına neden olabilecek herhangi bir sıvıyı hesaba katmak için en az iki ek doz yapın.
