$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
>1. Numune hazırlama
- Periferik kanı 9 mL heparinize tüplerde toplayın ve numuneyi deney protokolü için gerekli olana kadar bir rotorda oda sıcaklığında (RT) tutun.
- Negatif kontroller (2 tüp), pozitif kontroller (2 tüp) ve farklı alerjen / ilaç konsantrasyonları (test edilen her alerjen / ilaç konsantrasyonu için 1 tüp) için 5 mL sitometre tüplerini etiketleyin. Tüpleri, tüplerin kaymadan mükemmel şekilde oturduğu bir rafa yerleştirin.
- % 2 (h / h) HEPES, 78 mg / L NaCl, 3.7 mg / L KCl, 7.8 mg / L CaCl2, 3.3 mg / L MgCl2, 1 g / L HSA içeren çift damıtılmış suda stimülasyon tamponu hazırlayın. PH'ı 7.4'e ayarlayın ve 2 ng / mL'de IL-3 ekleyin. Genellikle 100 mL hazırlayın ve -20 °C'de dondurulmak üzere 2,5 mL'lik alikotlara bölün.
- PBS-Tween-20'de pozitif kontroller hazırlayın %0,05 (h/h) (PBS-T): Pozitif kontrol 1, N-Formil metiyonil-lösil-fenilalanin (fMLP) (4 μM), bazofillerin kalitesini doğrulamak için; Pozitif kontrol 2, IgE aracılı pozitif kontrol olarak Anti-IgE (0.05 mg / mL).
- Alerjeni / ilacı PBS-T'de istenen nihai konsantrasyonun 2 katında hazırlayın.
not: Kullanılacak optimal alerjen/ilaç konsantrasyonları, daha önce geniş bir konsantrasyon aralığı kullanılarak, doz-yanıt eğrileri ve aynı protokol adımlarını izleyen sitotoksisite çalışmaları ile belirlenmelidir.
2. Boyama karışımı hazırlama
- Üreticinin tavsiye ettiği antikor konsantrasyonunu takiben veya önceki antikor titrasyonu ile stimülasyon tamponuna florokrom ile etiketlenmiş monoklonal antikorlar ekleyin. Bu protokolde, bazofil tanımlaması için her antikordan 1 μL (CCR3-APC ve CD203c-PE; Bazofil aktivasyonu için CD63-FITC) 20 μL stimülasyon tamponu başına.
not: Boyama karışımı hazırlığını ışıktan koruyun.
- Her tüpe 23 μL boyama karışımı ekleyin.
3. Kan stimülasyonu
- Tüp 1 ve 2'ye 100 μL PBS-T (negatif kontrol), tüp 3'e 100 μL fMLP, tüp 4'e 100 μL anti-IgE ve aşağıdaki tüplere 100 μL farklı alerjen / ilaç konsantrasyonları ekleyin. Reaktifleri önceden ısıtmak için orta ajitasyonlu termostatik bir banyoda 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
- Hemolizi önlemek için her tüpe yavaşça 100 μL kan ekleyin. Tüpleri nazikçe girdap haline getirin ve orta ajitasyonlu termostatik bir banyoda 37 ° C'de 25 dakika inkübe edin.
- Tüpleri en az 5 dakika 4 °C'de tutarak degranülasyonu durdurun.
not: Protokol burada gerekirse 4 °C'de 30-45 dakika duraklatılabilir.
4. Eritrositlerin parçalanması
- Eritrositleri parçalamak için her tüpe 2 mL 1x lizasyon tamponu ekleyin. Her tüpü vorteksleyin ve RT.
'da 5 dakika inkübe edin
not: Bu adımda, tampon içinde bulunan fiksatif ajanlar (formaldehit) nedeniyle hücreler sabitlenir.
- 300 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın, rafı bir lavaboya çevirin. Hücreler tüplerin dibinde kalır.
- Hücreleri yıkamak için her tüpe 3 mL PBS-T ekleyin. Her tüpü girdaplayın.
- 300 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın, rafı bir lavaboya çevirin.
not: Numuneleri 4 °C'de, akış sitometresi elde edilene kadar ışıktan koruyun.
5. Akış sitometrisi edinimi
- Akış sitometresi ile numune alın (örneğin, BD FACSCalibur Akış Sitometresi). Akış sitometresini bilgisayar yazılımına bağlayın ve sitometrenin hazır olmasını bekleyin. Şablonu ve cihaz ayarlarını yükleyin (Tablo 1).
- Örnek alımını başlatın.
- Aktive edilmiş bazofillerin seçimi için aşağıdaki sitometre stratejilerini kullanın.
- Lenfositleri Yan Saçılma (SSC) - İleri Saçılma (FSC) grafiğinden geçirin.
- Lenfosit popülasyonundaki bazofilleri CCR3 + CD203c + hücreleri olarak kapılayın. Tüp başına en az 500 bazofil elde edin.
- Aktivasyon işaretçisi olarak CD63 kullanarak aktivasyonu analiz etmek için bir CCR3 - CD63 grafiği gösterin. Negatif kontrol tüplerini kullanarak CD63 negatif eşiğini yaklaşık% 2.5'e ayarlayın.
- Tüm örnekleri alın.
Tablo 1: Akış sitometresi gereksinimleri
| Işık Kaynakları (lazerler) | 488 nm Coherent SapphireTM hava soğutmalı argon-iyon lazer; 20 mW; 633 nm JDS UniphaseTM HeNe hava soğutmalı lazer; 17 mW |
| Işık uyarıcı dalga boyu | Mavi lazer: 488 nm; Kırmızı lazer: 633 nm |
| Uyarıcı dalga boyunda ışık kaynağı gücü | Mavi lazer: 20 mW; Kırmızı lazer: 17 mW |
| Optik filtreler | SSK: 488/10; FITC: 530/30, PE:585/42, APC: 660/20 |
| Optik dedektörler | FSC, SSC, FL1-H FITC, FL2-H PE, FL4-H APC |
| Optik dedektörler tye | Hava soğutmalı argon-iyon lazer |
| Optik yollar | BD sekizgen (488 nm lazer çizgisi); BD Trigons (633 nm lazer çizgisi) |