Flow Sitometri Kullanarak Bir Test Alerjeni Varlığında Bazofil Aktivasyonunun Analiz Edilmesi

Özet

Kaynak: Doña, I. ve ark., Alerji Teşhisi için Bazofil Aktivasyon Testi. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu videoda, akış sitometrisi kullanarak bir test alerjeninin varlığında bazofil aktivasyonunu değerlendirmek için testi gösteriyoruz.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

>1. Numune hazırlama

1. Periferik kanı 9 mL heparinize tüplerde toplayın ve numuneyi deney protokolü için gerekli olana kadar bir rotorda oda sıcaklığında (RT) tutun.
2. Negatif kontroller (2 tüp), pozitif kontroller (2 tüp) ve farklı alerjen / ilaç konsantrasyonları (test edilen her alerjen / ilaç konsantrasyonu için 1 tüp) için 5 mL sitometre tüplerini etiketleyin. Tüpleri, tüplerin kaymadan mükemmel şekilde oturduğu bir rafa yerleştirin.
3. % 2 (h / h) HEPES, 78 mg / L NaCl, 3.7 mg / L KCl, 7.8 mg / L CaCl₂, 3.3 mg / L MgCl₂, 1 g / L HSA içeren çift damıtılmış suda stimülasyon tamponu hazırlayın. PH'ı 7.4'e ayarlayın ve 2 ng / mL'de IL-3 ekleyin. Genellikle 100 mL hazırlayın ve -20 °C'de dondurulmak üzere 2,5 mL'lik alikotlara bölün.
4. PBS-Tween-20'de pozitif kontroller hazırlayın %0,05 (h/h) (PBS-T): Pozitif kontrol 1, N-Formil metiyonil-lösil-fenilalanin (fMLP) (4 μM), bazofillerin kalitesini doğrulamak için; Pozitif kontrol 2, IgE aracılı pozitif kontrol olarak Anti-IgE (0.05 mg / mL).
5. Alerjeni / ilacı PBS-T'de istenen nihai konsantrasyonun 2 katında hazırlayın.
   not: Kullanılacak optimal alerjen/ilaç konsantrasyonları, daha önce geniş bir konsantrasyon aralığı kullanılarak, doz-yanıt eğrileri ve aynı protokol adımlarını izleyen sitotoksisite çalışmaları ile belirlenmelidir.

2. Boyama karışımı hazırlama

1. Üreticinin tavsiye ettiği antikor konsantrasyonunu takiben veya önceki antikor titrasyonu ile stimülasyon tamponuna florokrom ile etiketlenmiş monoklonal antikorlar ekleyin. Bu protokolde, bazofil tanımlaması için her antikordan 1 μL (CCR3-APC ve CD203c-PE; Bazofil aktivasyonu için CD63-FITC) 20 μL stimülasyon tamponu başına.
   not: Boyama karışımı hazırlığını ışıktan koruyun.
2. Her tüpe 23 μL boyama karışımı ekleyin.

3. Kan stimülasyonu

1. Tüp 1 ve 2'ye 100 μL PBS-T (negatif kontrol), tüp 3'e 100 μL fMLP, tüp 4'e 100 μL anti-IgE ve aşağıdaki tüplere 100 μL farklı alerjen / ilaç konsantrasyonları ekleyin. Reaktifleri önceden ısıtmak için orta ajitasyonlu termostatik bir banyoda 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
2. Hemolizi önlemek için her tüpe yavaşça 100 μL kan ekleyin. Tüpleri nazikçe girdap haline getirin ve orta ajitasyonlu termostatik bir banyoda 37 ° C'de 25 dakika inkübe edin.
3. Tüpleri en az 5 dakika 4 °C'de tutarak degranülasyonu durdurun.
   not: Protokol burada gerekirse 4 °C'de 30-45 dakika duraklatılabilir.

4. Eritrositlerin parçalanması

1. Eritrositleri parçalamak için her tüpe 2 mL 1x lizasyon tamponu ekleyin. Her tüpü vorteksleyin ve RT.
   'da 5 dakika inkübe edin not: Bu adımda, tampon içinde bulunan fiksatif ajanlar (formaldehit) nedeniyle hücreler sabitlenir.
2. 300 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın, rafı bir lavaboya çevirin. Hücreler tüplerin dibinde kalır.
3. Hücreleri yıkamak için her tüpe 3 mL PBS-T ekleyin. Her tüpü girdaplayın.
4. 300 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın, rafı bir lavaboya çevirin.
   not: Numuneleri 4 °C'de, akış sitometresi elde edilene kadar ışıktan koruyun.

5. Akış sitometrisi edinimi

1. Akış sitometresi ile numune alın (örneğin, BD FACSCalibur Akış Sitometresi). Akış sitometresini bilgisayar yazılımına bağlayın ve sitometrenin hazır olmasını bekleyin. Şablonu ve cihaz ayarlarını yükleyin (Tablo 1).
2. Örnek alımını başlatın.
3. Aktive edilmiş bazofillerin seçimi için aşağıdaki sitometre stratejilerini kullanın.
   1. Lenfositleri Yan Saçılma (SSC) - İleri Saçılma (FSC) grafiğinden geçirin.
   2. Lenfosit popülasyonundaki bazofilleri CCR3 ⁺ CD203c ⁺ hücreleri olarak kapılayın. Tüp başına en az 500 bazofil elde edin.
   3. Aktivasyon işaretçisi olarak CD63 kullanarak aktivasyonu analiz etmek için bir CCR3 - CD63 grafiği gösterin. Negatif kontrol tüplerini kullanarak CD63 negatif eşiğini yaklaşık% 2.5'e ayarlayın.
   4. Tüm örnekleri alın.

Tablo 1: Akış sitometresi gereksinimleri

Işık Kaynakları (lazerler)	488 nm Coherent SapphireTM hava soğutmalı argon-iyon lazer; 20 mW; 633 nm JDS UniphaseTM HeNe hava soğutmalı lazer; 17 mW
Işık uyarıcı dalga boyu	Mavi lazer: 488 nm; Kırmızı lazer: 633 nm
Uyarıcı dalga boyunda ışık kaynağı gücü	Mavi lazer: 20 mW; Kırmızı lazer: 17 mW
Optik filtreler	SSK: 488/10; FITC: 530/30, PE:585/42, APC: 660/20
Optik dedektörler	FSC, SSC, FL1-H FITC, FL2-H PE, FL4-H APC
Optik dedektörler tye	Hava soğutmalı argon-iyon lazer
Optik yollar	BD sekizgen (488 nm lazer çizgisi); BD Trigons (633 nm lazer çizgisi)

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
5 mL Yuvarlak Tabanlı Polistiren Test Tüpü, Kapaksız, Steril Olmayan	Corning	352008
APC anti-insan CD193 (CCR3) Antikoru	Biyo Efsane	310708
BD FACSCalibur Akış Sitometresi	BD Biyolojik Bilimler
Kalsiyum klorür	Sigma-Aldrich	C1016
FITC anti-insan CD63 Antikoru	Biyo Efsane	353006
HEPES (1 M)	Termo-Balıkçı	15630106
Lysing Çözeltisi 10x konsantre	BD Biyolojik Bilimler	349202
Magnezyum klorür	Sigma-Aldrich	M8266
N-Formil-Met-Leu-Phe	Sigma-Aldrich	F3506
PE anti-insan CD203c (E-NPP3) Antikoru	Biyo Efsane	324606
Potasyum klorür	Sigma-Aldrich	P9541 Serisi
Saflaştırılmış Fare Anti-İnsan IgE	BD Biyolojik Bilimler	555857
Rekombinant İnsan IL-3	Ar-Ge Sistemleri	203-IL
Kılıf Sıvısı	BD Biyolojik Bilimler	342003
Sodyum klorür	Sigma-Aldrich	S3014 Serisi
TÜP 9 mL LH Lityum Heparin	Greiner Bio-Bir	455084
Ara 20	Sigma-Aldrich	P1379 Serisi

Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Gazetesi Gazetesi