$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Mikroenjeksiyon İğnelerinin Hazırlanması
- Aşağıdaki ayarlara sahip bir mikropipet çektirme cihazı kullanarak ince duvarlı cam kılcal enjeksiyon iğnelerini (1.0 OD / 0.75 ID) hazırlayın: hava basıncı 200, ısı 502, çekme 90, hız 80, zaman 70, çekme başlangıcında hava süresi 5, çekme sonunda hava süresi 5.
- İnce cımbız kullanarak, çekilen iğnenin ucunu, uç açıklığının çapı yaklaşık 10 μm olacak şekilde kırın.
2. Larva Enjeksiyon Yemeklerinin Hazırlanması
- Şerit genişliği yaklaşık 4-5 mm olan bir jel tarağı steril suda durulayın ve kurumasını bekleyin.
- Çözelti berraklaşana kadar E3 ortamında ve mikrodalgada% 1.5-2 oranında eriyen bir agaroz çözeltisi hazırlayın. Soğuduktan sonra, agarozun bir kısmını bir Petri kabına (100 x 15 mm) dökün ve kabın altını tamamen kaplayacak kadar agaroz ekleyerek
döndürün.
- Agaroz tabakası katılaştıktan sonra, durulanmış ve kurutulmuş jel tarağı, taranmamış uç Petri kabının üstünde duracak ve taranmış uç agaroza değecek şekilde üstüne yerleştirin. Tarağın mümkün olduğunca yatay olduğundan ve alt agaroz tabakasına göre 30°'lik bir açı oluşturduğundan emin olun.
- Tarak ve alt agaroz tabakası arasındaki arayüze az miktarda agaroz dökün, böylece taze agaroz tabakası tarağın kuyularını kaplar. Tarağı çıkarmadan önce tamamen soğumasını bekleyin. Bir pipet ucu kullanarak, oyuklardan sarkan agaroz parçalarını çıkarın.
- E3 ortamını enjeksiyon kalıbının üzerine dökün ve 4 °C'de saklayın.
- Her kullanımdan önce, enjeksiyondan en az bir saat önce 28.5 ° C'de taze orta ve ılık enjeksiyon rampaları ile değiştirin.
- Enjeksiyonlardan hemen önce, enjeksiyon rampasındaki E3'ü 200 μg/ml etil 3-aminobenzoat (trikain) içeren bir E3 ortamı ile değiştirin.
3. Streptococcus iniae (S. iniae) Aşısının Hazırlanması
- %0,2 maya özütü ve %2 proteoz pepton (THY+P) ile takviye edilmiş Todd Hewitt et suyu ortamını hazırlayın ve otoklavlayın: 30 g/L Todd Hewitt, 2 g/L maya özütü, 20 g/L proteoz pepton. Agar plakaları için 14 g/L agar ekleyin.
- Enfeksiyonlardan bir gece önce, kapalı 15 ml'lik bir tüpte 10 ml THY + P suyuna 100 μl donmuş bakteri suyu pipetleyerek bakteri kültürlerini hazırlayın. 37 ° C'de çalkalamadan gece boyunca inkübe edin. 14-16 saatlik büyümeden sonra, gece boyunca kültürü ya dondurucu stokları yapmak ya da enjeksiyonlarda kullanıma hazırlamak için kullanın.
- 1.7 ml'lik bir santrifüj tüpüne 500 μl %80 gliserol içinde 1 ml gece kültürü yerleştirerek dondurucu stokları yapın. Donma-çözülme döngülerini önlemek için, bu karışımdan 100 μl tek kullanımlık alikotlar yapın ve bunları -80 °C'de saklayın.
- Enfeksiyonlarda kullanılan S. iniae için, 9.9 ml THY + P suyuna 0.1 ml gece kültürü ekleyerek toplam 10 ml kültür hacmi için gece kültürünü 1:100 oranında seyreltin. 37 ° C'de yaklaşık 4-5 saat çalkalamadan büyütün. Bir Nanodrop spektrofotometresi kullanarak 600 nm'de optik yoğunluğu (OD) izleyin ve OD600 nm 0.250-0.500'e ulaştığında bakterileri orta logaritmik fazda hasat edin. 0.250'lik bir OD600 nm, yaklaşık 108 koloni oluşturan birime (CFU)/ml'ye karşılık gelir.
- 1.7 ml'lik bir santrifüj tüpünde 1.500 x g'da 5 dakika boyunca 1 ml bakteri kültürünü peletleyin. 1 ml taze fosfat tamponlu salin (PBS) içinde tekrar süspanse edin ve tekrarlayın. İstenilen konsantrasyonu elde etmek için PBS, pelet ve PBS'deki bakterilerin OD600 nm'sini ölçün.
- Mikroenjeksiyonun görselleştirilmesine yardımcı olmak için, enjeksiyondan önce %0.1'lik bir nihai konsantrasyon için bakteriyel süspansiyonlara fenol kırmızısı ekleyin.
- Isıyla öldürülmüş bakterilerin enjeksiyonunu içeren deneyler için, bakterileri PBS'de 95 ° C'de 30 dakika ısıtın. Isıyla öldürme işleminin, katı THY + P agar plakaları üzerine bir enjeksiyon hacmi (yaklaşık 1 nl) kaplayarak ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe ederek canlı bakteri sayısını tespit edilemeyen seviyelere düşürdüğünü doğrulayın.
4. S. iniae'yi CellTracker Kırmızı Floresan Boya ile etiketleme
- Canlı bakteri hücrelerini etiketlemek için bir CellTracker floresan boyası veya eşdeğerinden oluşan bir stok çözeltisi hazırlayın. Kullanılan boya 20 x 50 μg alikot toz halinde geldiğinden ve dimetil sülfoksit (DMSO) içinde yeniden süspanse edilmesi gerektiğinden, 10 mM'lik bir stok konsantrasyonu elde etmek için tüpe 7.3 μl DMSO ekleyin.
- Hücreleri lekeleyen en düşük optimal konsantrasyonu belirlemek için bakteriler üzerinde bir dizi boya konsantrasyonunu (örneğin, 0.5-25 μM) test edin. Hızla bölünen hücreler ve daha uzun deneyler daha yüksek bir boya konsantrasyonu gerektirebilir.
- 1.0 ml'lik bakteri kültürünü 1.7 ml'lik bir tüpte yukarıda tarif edildiği gibi santrifüjleme ile pelet haline getirin (bölüm 3). Peleti 1 ml taze PBS'de tekrar süspanse edin ve bakteri kültürüne uygun hacimde boya ekleyin.
- 37 ° C'de 30 dakika boyunca çalkalama olmadan inkübe edin. Bakterileri döndürün ve 1 ml önceden ısıtılmış THY + P suyunda yeniden süspanse edin ve 37 ° C'de 30 dakika daha çalkalamadan inkübe edin.
- OD600 nm'yi ölçmeden ve bakterileri yukarıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi mikroenjeksiyon için seyreltmeden önce bakterileri döndürün ve PBS'de iki kez yıkayın (bölüm 3). Lökosit alımı ve fagositoz çalışmalarımız için tipik olarak 1 nl enjeksiyon hacminde yaklaşık 100 CFU enjekte ediyoruz.
5. Zebra Balığı Larvalarının Enfeksiyonlara Hazırlanması
- Bir gece önceden üreme çiftleri kurun ve Rosen ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi embriyoları toplayın.Embriyoları enfekte olmaya hazır olana kadar E3 ortamında 28.5 ° C'de inkübe edin.
- Görüntülenecek zebra balığı için, 0.2 nM'lik bir nihai konsantrasyon için gübrelemeden 24 saat sonra (hpf) E3 ortamına N-Feniltiüre (PTU) ekleyerek pigment gelişimini (melanizasyon) önleyin.
- Döllenmeden 2 gün sonra (dpf) yaşlanan embriyoları içeren enfeksiyonlar için, embriyoları bir çift ince cımbızla manuel olarak dekoryonatın. Alternatif olarak, E3'ü çıkararak ve bunları pronazaz (2 mg / ml) ile değiştirerek yaklaşık 5 dakika boyunca veya hafif pipetleme embriyoları koryondan ayırana kadar embriyoları dekoryonlaştırın. Çoğu larva doğal olarak 3 dpf tarafından yumurtadan çıkmış olmalıdır.
- Enfeksiyondan birkaç dakika önce zebra balıklarını, dekoryonlu larvaları 200 μg/ml trikat içeren bir E3 ortamına yerleştirerek uyuşturun.
>6. S. iniae'nin Üç Günlük Larvalara Otik Vezikül Enjeksiyonu
- Mikro enjektörü açın ve zaman aralığını "milisaniye" olarak ayarlayın. Gazın hatta girmesine izin vermek için karbondioksit tankındaki vanayı açın. Mikroenjektörün basıncı, inç kare (PSI) başına yaklaşık 20 pound okumalıdır. Mikroenjektör ünitesindeki basıncı, artan basınç için siyah tırtıllı düğmeyi saat yönünde çevirerek veya basıncı azaltmak için saat yönünün tersine çevirerek ayarlayın.
- Hazırlanan S. iniae kültürünü fenol kırmızısı ve PBS'de vorteksleyin ve kültürün 2-3 μl'sini çekilmiş bir kılcal enjeksiyon iğnesine yüklemek için bir mikro yükleyici ucu kullanın.
- Yüklenen iğneyi manyetik bir standa bağlı bir mikromanipülatöre monte edin ve iğne mikroskobun tabanına göre yaklaşık 45-65° açıda olacak şekilde bir stereomikroskop altına yerleştirin.
- İğnenin ucuna bir damla aşı damlatmak için mikroenjektörün ayak pedalına basın. Mikroskobun oküler merceğindeki ölçek çubuğunu kullanarak damlanın çapını ölçün.
- Alternatif olarak, bir ölçek çubuğu ile bir cam mikroskop lamı üzerindeki bir damla mineral yağa bir hacim enjekte ederek damlanın çapını tahmin edin. Damlanın çapı yaklaşık 0.10 mm olmalıdır, bu da yaklaşık 1 nl hacimdir.
- Mikroenjektör üzerindeki süre ayarını ayarlayarak veya ince cımbızla iğne ucunun daha fazlasını keserek damla boyutunu ayarlayın. Çok fazla doku hasarına neden olmamak için enjeksiyon süresinin 20 - 35 msn arasında olması gerektiğini unutmayın.
- Plastik bir transfer pipeti kullanarak, anestezi uygulanmış 12 larvayı enjeksiyon kalıbının her bir oyuğuna aktarın.
- Larvaları, başları mikroskobun arkasına doğru bakacak ve yumurta sarısı keseleri kuyunun sol tarafına dayanacak şekilde nazikçe konumlandırmak için bir cam çubuk, saç halkası veya plastik uç kullanın. Larvanın sol kulağını tavana doğru doğrultun.
- Stereomikroskobun oküler merceğinden bakarak, yüklü iğneyi otik vezikül ile hizalamak için mikromanipülatör üzerindeki düğmeleri kullanın, böylece her ikisi de aynı görüş alanında olur. Otik vezikülün dış epitel tabakasını iğne ucuyla delin, böylece iğne ucu vezikülün hemen içinde olur.
- İstenilen dozda S. iniae'den 1 nl enjekte etmek için ayak pedalına basın. Boşluğu yırtmamak için yeterince düşük bir basınç kullandığınızdan emin olun. Enjeksiyon başarılı olursa, otik vezikül, ancak çevresindeki doku değil, fenol kırmızı inokül ile dolmalıdır (Şekil 1 Ai). Yanlış enjekte edilmiş balıkları enjeksiyon plakasından hemen çıkarın.
- İğneyi larvadan dikkatlice geri çekin ve enjeksiyon plakasını bir sonraki larva görünecek şekilde elle hareket ettirin. Bunu 5X büyütme altında yapın.
not: İğnenin geri çekilmesi, otik vezikülün dışında bazı bakterilerin birikmesine neden olabilir, bu da sağkalımı ve lökosit alım sonuçlarını çarpıtabilir. Bunu önlemek için, floresan boya etiketli bakterilerin enjekte edilmesi ve enjekte edilen larvaların, bunun meydana geldiği larvaları çıkarmak için bir floresan mikroskop altında görsel olarak taranması önerilir. Doğru enjekte edilmiş bir larva gösterilmiştir (Şekil 1 Bi).
- Enjeksiyon hacminin / aşılamanın deney boyunca aynı kalmasını sağlamak için, her 48. embriyodan sonra 100 μl steril PBS içeren 1.7 ml'lik bir santrifüj tüpüne bir damla bakteri süspansiyonu enjekteedin. Enjeksiyon hacmindeki CFU'yu belirlemek için 100 μl'yi gece boyunca 37 °C'de THY+P agar plakalarına yerleştirin.
- Enjeksiyon rampasındaki 12 larva grubunun tamamı enjekte edildiğinde, larvaları kuyucuklardan çıkarmak için dikkatlice plastik bir transfer pipeti kullanın ve yeni bir Petri kabına (35 x 10 mm2) yerleştirin. Trikin solüsyonunu çıkarın ve larvaların iyileşmesini sağlamak için yaklaşık 2 ml taze E3 ortamı ile değiştirin.
- Pipet, larvaları 96 oyuklu bir plakanın tek oyuğuna enjekte etti ve 28.5 ° C'de inkübe edildi. Bu plakalarda hayatta kalmak için larvaları zaman içinde izleyin veya daha sonra görüntüleme veya CFU sayımları için çıkarın.
7. Görüntüleme için Larvaların Fiksasyonu
- Larvaları, bölüm 7'de açıklandığı gibi PBS çözeltisinde buz gibi soğuk% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin.
- Oda sıcaklığında, görüntülemeden önce PBS'de her biri 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
8. Canlı Görüntüleme için Larvaların Hazırlanması
- Çözelti berraklaşana kadar mikrodalgada ısıtarak E3'te% 1.5 düşük erime noktalı bir agaroz çözeltisi hazırlayın.
- Agaroz solüsyonunu soğuması için 55 °C'lik bir su banyosuna koyun, ancak sertleşmemesini sağlayın.
- Agaroza% 0.016'lık bir nihai konsantrasyona kadar trikserin ekleyin.
- Plastik bir transfer pipeti kullanarak, 4-5 anestezi uygulanmış larvayı stereomikroskop sahnesinde cam tabanlı bir tabağa yerleştirin.
- Trikasil ve agaroz solüsyonunu 55 °C su banyosundan çıkarın ve oda sıcaklığında 1-2 dakika soğumaya bırakın. Agaroz soğurken, anestezi uygulanmış larvalardan mümkün olduğunca fazla sıvı alın.
- Soğutulmuş agarozu, yüzeyin yaklaşık yarısı kaplanana kadar tabağa dökün. Agarozu yaymak için tabağı döndürün. Agaroz çok sıcaksa larvaları öldüreceğini unutmayın. Ayrıca, tabağa çok fazla agaroz eklenirse, mikroskobun objektif merceği, agarozdan odaklanırken tabağın dibine çarpabilir.
- Bir transfer pipeti kullanarak, tabağın kenarlarına doğru yüzen larvaları toplayın ve tekrar merkeze pipetleyin.
- Stereomikroskop altında, larvaları bir saç halkası, uzun bir pipet ucu veya bir cam çubukla istediğiniz gibi nazikçe konumlandırın. Otik vezikülün görüntülenmesi için larvaları, sol otik vezikül tabağın dibine doğru düz olacak şekilde konumlandırın.
- Tabağı hareket ettirmeden önce agarozu yaklaşık 10 dakika soğumaya bırakın. Agaroz katı değilse larvalar pozisyon değiştirebilir. Nemli tutmak için agaroz tabakasının üstüne bir miktar tricaine ve E3 solüsyonunu nazikçe pipetleyin.
9. Enfeksiyonun Konfokal Görüntülenmesi
- Larvaların bulunduğu cam alt tabağı, FV-1000 lazer taramalı konfokal sistemli ters çevrilmiş bir mikroskop sahnesine yerleştirin.
- İğne deliğini 200-300 μm'ye ayarlayın ve sayısal diyafram açıklığı 0.75/20X objektif lensi kullanarak z-yığınlarını 3-6 μm'lik dilimlerle ayarlayın.
- Her kanal için lazer gücünü ve dedektör kazancını ayarlamak için sürekli çizgi taramayı kullanın.
- Her floresan kanalı (örneğin, 488 ve 543 nm) ve diferansiyel girişim kontrastı (DIC) için sıralı çizgi taraması kullanarak, nötrofiller ve makrofajlar tarafından ilk işe alımı ve fagositozu gözlemlemek için 2-6 saat boyunca her 3 dakikada bir sol otik vezikülün hızlandırılmış bir filmini yapın. Daha uzun süreli kurslar için, agarozun buharlaşmasını ve kurumasını önlemek için Petri kabının üzerine bir kapak yerleştirin.
- Sabit (Şekil 1B) veya canlı (Şekil 2) larvaların 20X veya 40X büyütmede hareketsiz görüntülerini elde edin.
10. Otik Vezikülde Dendra2 işaretli lökositlerin fototransformasyonu
NOT: Dendra2, 405 nm'lik bir lazeri (%50-70 lazer gücü yeterli olmalıdır) 1 dakika boyunca ilgilenilen bölgeye (ROI) odaklayarak yeşilden kırmızı floresana fototransforme edilebilir. FV-1000 lazer tarama konfokal sistemi için kullanılan adım adım protokol aşağıdadır:
- 488 nm ve 543 nm lazerlerle z-stack taraması kullanarak örneği görselleştirin. Lazer gücünü ve dedektör kazancını ayarlamak için sürekli çizgi taramayı kullanın. Yanlışlıkla foto dönüştürülmüş kırmızı floresan olmadığından emin olmak için kontrol edin.
- "Görüntü Edinme Kontrolü" penceresinde, "Uyaran Ayarı" altında "Tarayıcıyı Kullan" aracını seçin ve "Ana"yı seçin. 405 nm lazeri seçin ve% 70 güce ayarlayın. Daire seçeneğini kullanarak, otik veziküldeki ROI'yi tanımlayın.
- "Uyaran Başlangıç Ayarı" altında, 1 kare ön aktivasyon ve 60.000 msn aktivasyon süresi ile "Seri aktivasyon"u seçin. "Zaman Taraması başlığı" altındaki "Edinme Ayarı" penceresinde, 00:01:00'lık 2 aralık seçin (biri foto dönüştürme öncesi ve diğeri foto dönüştürme sonrası için).
not: Hızlandırılmış seri taraması tamamlandıktan sonra, Dendra2'nin kırmızı floresan durumuna foto dönüşümü yapılmış olmalıdır.
- Fotodönüştürülmüş kırmızı floresansı ve kalan yeşil floresansı görselleştirmek için 488 nm ve 543 nm lazerleri kullanarak numuneyi bir z-yığını ile tarayın (Şekil 3).
