1. Flow Sitometrisi ve Lenfosit Alt Tiplerinin Sınıflandırılması
NOT: Lenfositleri hücre tipine göre sıralamak, denetimli öğrenmede bir hücre tipi sınıflandırıcısını eğitmek ve test etmek için temel gerçek (yani doğru) hücre tipi etiketlerini oluşturmak için gereklidir. Altın standart bir yöntem olan akım sitometrisi, lenfositleri tanımlamak ve ayırmak için kullanılır.
- 100 μL taze RPMI-1640 ortamında [% 10 FBS, 0.1 μg CD3e (17A2), CD8a (53-6.7), CD19 (1D3), CD45R (B220, RA3-6B2) ve NK1.1 (PK136) ile yüzey işaretleyici boyama antikorlarının bir karışımını yapın ve 0.25 μg CD4 (GK1.5) antikorları hedef B, CD4 + T ve CD8 + T lenfositlerine karşı.
- Hücre süspansiyonuna 100 μL antikor karışımı ekleyin.
- Buz üzerinde 25 dakika inkübe edin.
- Hücreleri 5 mL PBS ekleyerek ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca iki kez 400 x g'da santrifüjleyerek yıkayın.
- Hücre peletini% 10 FBS ve 2.5 μg DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) ile 5 mL taze RPMI-1640 ortamında yeniden süspanse edin.
- Yukarıda açıklanan belirteçlerin floresan seviyelerini kullanarak her bir lenfosit tipini akış sitometrisi ile ayrı ayrı toplayın. DAPI sinyallerini kullanarak ölü hücreleri aynı anda hariç tutun.
>2. 3D Kantitatif Faz Görüntüleme
- Hücre hasarını ve biyokimyasal değişiklikleri önlemek için 5 saat içinde (fareden lenfosit izolasyonundan bu yana) tamamlanması gereken görüntüleme prosedürleri boyunca sıralanan lenfositleri buz üzerinde tutun.
- Sıralanmış bir hücre tipi seçin (B, CD4 + T ve CD8 + T lenfositleri arasında) ve optimum görüntüleme koşulları için numuneyi RPMI ortamı ile 180 hücre / μL'ye seyreltin (yani, tek görüş alanı başına bir hücre).
- Seyreltilmiş numunenin 120 μL'sini yavaş enjeksiyonla bir görüntüleme odasına yükleyin. Numune ile görüntüleme odasındaki kabarcıkların varlığını iyice kontrol edin. Kabarcıklar varsa, ölçümlerin kalitesini tehlikeye atacakları için bunları dikkatlice çıkarın.
- Ticari bir 3D kantitatif faz mikroskobu veya holotomografi ve görüntüleme yazılımını kullanarak 3D RI tomogramları edinin.
NOT: Deney düzeneği ile ilgili detaylı bilgi orijinal el yazması içerisinde yer almaktadır.
- Mikroskobun objektif merceğinin üzerine bir damla damıtılmış su koyun.
- Numunenin bulunduğu görüntüleme odasını mikroskobun translasyon aşamasına yerleştirin ve konumunu, numune objektif lens ile hizalanacak şekilde ayarlayın.
- Görüntüleme yazılımının "Mikroskop" perspektifinin "Kalibrasyon" sekmesinde sırasıyla Odak ve Yüzey'e tıklayarak objektif ve kondansatör merceklerin eksenel konumlarını ayarlayın.
- Otomatik Mod'a tıklayarak objektif ve kondansatör lenslerini hizalayın. Alternatif olarak, Tarama Modunu kullanın ve aydınlatma desenleri görüş alanının merkezi bölgesinde lokalize olacak şekilde lensleri manuel olarak ayarlayın.
- Normal Mod'a dönün ve görüş alanındaki bir hücreyi bulmak için çeviri aşamasını ayarlayın.
- Objektif merceğin eksenel konumunu ayarlayarak odak düzlemini bulun. Mükemmel odaklama, ekranda görselleştirilen örnek sınırını neredeyse görünmez hale getirir.
- Hücresi olmayan bir konum bulmak için çeviri aşamasını ayarlayın.
- Farklı aydınlatma açılarına sahip birden çok 2B hologramı ölçmek için Ayarla'ya tıklayın.
- Görüş alanının ortasındaki bir hücreyi bulmak için çeviri aşamasını ayarlayın.
- "Alım" sekmesine gidin ve 2.4.8 adımında yapılanla aynı aydınlatma açılarına sahip hücrenin hologramlarını ölçmek için 3D Anlık Görüntü'ye tıklayın.
- Elde edilen veriler "Veri Yönetimi" panelinde sunulduğunda, elde edilen verilere sağ tıklayın ve görüntüleme yazılımında uygulanan kırınım tomografisi algoritmasını kullanarak 2.4.8 ve 2.4.10 adımlarında ölçülen hologramlardan bir 3D RI tomogramı yeniden oluşturmak için İşlem'e tıklayın.
- Makine öğrenimi için istatistiksel güç sağlamak üzere 100'den fazla hücreyi ölçmek için 2.4.5-2.4.11 adımlarını tekrarlayın.
- Adım 2.4.11. ile işlenen tüm görüntüler görselleştirilebilir. "Veri Yönetimi" panelinde, verilere sağ tıklayın ve verileri görselleştirmek için Aç'a tıklayın. "Veri Yöneticisi" panelinde RI Tomogram'a tıklayın. "Ön Ayar" sekmesinde, Yükle'ye tıklayın ve tomogramı 3D RI dağılımlarına göre görselleştirmek için görüntüleme yazılımı tarafından sağlanan önceden tanımlanmış bir aktarım işlevi olan "lymphocyte.xml" seçeneğine çift tıklayın.
- Tüm lenfosit alt tiplerinin 3D RI tomogramlarını ölçmek için 2.2-2.4 adımlarını tekrarlayın.
