Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir
>1. Hastalardan Kan Alınması
DİKKAT: Hastadan tam kan alırken uygun laboratuvar güvenlik önlemlerini alın. Eldiven ve gözlük kullanın. Hasta izolasyon altındaysa, lütfen biyogüvenlik seviye 4 prosedürlerini izleyin.
- Hastadan intravenöz tam kan almak için, küçük delikli uzatma borulu bir kelebek iğne ve bir lizis / bağlama tamponu içeren bir kan alma vakum tüpü kullanın. Hastanın kolunu aşağı doğru pozisyonda dinlendirin ve toplama tüpünü kelebek iğneden daha aşağıya yerleştirin. Kelebek iğneyi hastanın damarına sokun ve kan alma vakum tüpünü küçük delikli uzantıya takın.
not: Bu, geri akışı önleyecektir.
- Kan alındıktan sonra, tüpü 5 - 10 kez çevirerek tüpün içeriğini karıştırın.
not: 1.6 mL liziz/bağlayıcı tampon içeren kan alma tüpünde kalan vakum nedeniyle, toplanan numunenin hacmi otomatik olarak 1.6 mL olacaktır.
- Tüpün dışını %70 etanol kullanarak dezenfekte edin.
- Tüpleri oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
not: Protokol burada duraklatılabilir ve tam kan alma tüpleri -20 °C, 5 °C, 25 °C veya 37 °C'de en az 1 ay saklanabilir.
- Doğrudan basitleştirilmiş NA ekstraksiyon yöntemine devam edin.
2. Tam kanın basitleştirilmiş NA ekstraksiyonu
- NA'yı liziz/bağlayıcı tampon ile etkisiz hale getirilmiş toplanan kandan arındırmak için, vakum tüpünü elle 5 - 10 kez çevirerek tüpün içeriğini karıştırın.
- Tüpün kapağını dikkatlice çıkarın ve kapağı boşaltın.
- Hazırlanan MGP alikotunu (1 mL) doğrudan kan alma tüpüne dökün.
- Numuneyi içeren tüpe kullanılmayan bir kan alma tüpünden yeni bir kapak yerleştirin.
- Tüpün sıkıca kapatıldığından emin olmak için kapağın üzerine bir parmak yerleştirin ve kan alma tüpünü elinizle 5 - 10 kez çevirerek tüpün içeriğini karıştırın.
- Tüpü manyetik tutucuya yerleştirin ve tüpün sıkıca kapatıldığından emin olmak için parmağınızı kapağın üzerinde tutun.
- Tüm MGP'lerin mıknatısla birlikte tüpün yanında toplandığından emin olmak için manyetik tutucuyu tüple birkaç kez çevirin.
not: Manyetik tutucu, uzun bir mıknatıs ve bir lastik bant ile değiştirilebilir.
- Tüpün kapağını çıkarın ve tüpün içeriğini tek kullanımlık bir pipet kullanarak veya içeriği 50 mL'lik bir toplama tüpüne dökerek atın.
not: Tüpü bir kapakla kapatarak 50 mL toplama tüpünden aerosollerden kaçının.
- Hazırlanan yıkama tamponu-1 (WB-1, 4 mL) alikotunu doğrudan kan alma tüpüne dökün.
- Kapağı tüpün üzerine yerleştirin ve tüpün sıkıca kapatıldığından emin olmak için parmağınızı kapağın üzerine yerleştirin.
- Kapağı parmağınızla güvenli bir şekilde sıkarak tüpü manyetik tutucudan çıkarın.
not: Bir mıknatıs ve bir lastik bant kullanıyorsanız, lastik bandı ve mıknatısı tüpten çıkarmanız yeterlidir.
- Kan alma tüpünü elle 5-10 kez çevirerek MGP'leri yeniden askıya alın.
- 2.6 - 2.8 arasındaki adımları tekrarlayın.
- Hazırlanan WB-2 alikotunu (1.5 mL) doğrudan kan alma tüpüne dökün.
- Kapağı tüpün üzerine yerleştirin ve tüpü manyetik tutucudan çıkarın.
not: Bir mıknatıs ve bir lastik bant kullanıyorsanız, lastik bandı ve mıknatısı tüpten çıkarmanız yeterlidir.
- Tüpün sıkıca kapatıldığından emin olmak için parmağınızı kapağa yerleştirin.
- Kan alma tüpünü elle birkaç saniye çevirerek MGP'leri yeniden askıya alın.
- 2.6 - 2.8 arasındaki adımları tekrarlayın.
- Hazırlanan WB-3 alikotunu (3 mL) doğrudan kan alma tüpüne dökün.
- Kapağı tüpün üzerine yerleştirin ve tüpü manyetik tutucudan çıkarın.
not: Bir mıknatıs ve bir lastik bant kullanıyorsanız, lastik bandı ve mıknatısı tüpten çıkarmanız yeterlidir.
- Tüpün sıkıca kapatıldığından emin olmak için parmağınızı kapağa yerleştirin.
- Kan alma tüpünü elle 5-10 kez çevirerek MGP'leri yeniden askıya alın.
- 2.6 - 2.8 arasındaki adımları tekrarlayın.
- Hazırlanan elüsyon tamponu alikotunu (EB, 100 μL) doğrudan kan alma tüpüne dökün.
- Kapağı tüpün üzerine yerleştirin ve tüpü manyetik tutucudan çıkarın.
not: Bir mıknatıs ve bir lastik bant kullanıyorsanız, lastik bandı ve mıknatısı tüpten çıkarmanız yeterlidir.
- Kan alma tüpüne parmağınızla 5-10 kez vurarak EB'deki MGP'leri yeniden askıya alın.
not: Protokol burada duraklatılabilir ve tüpler -20 °C'de saklanabilir.
- Yeniden süspanse edilmiş MGP'lerin bir damlacığını (5 - 8 μL) 1.5 mL tek kullanımlık bir pipet kullanarak aşağı akış NA amplifikasyon reaksiyon karışımına aktarın (döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) / Ters transkripsiyon LAMP (RT-LAMP) veya kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) / RT-qPCR testleri kullanılabilir) .
not: NA'lar MGP'lere yapışacaktır, bu nedenle MGP'leri aşağı akış NA amplifikasyon reaksiyonunda kullandığınızdan emin olun. Kullanmadan önce MGP süspansiyonunu karıştırın. Karıştırdıktan sonra, MGP'ler tüpün dibinde toplanacaktır.
