$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Lipozomların Hazırlanması
- İstenilen nihai konsantrasyonda seyreltilmiş stoklar yapmak için 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DOPC) ve 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-kapaklı biyotinilin (Biotin-PE) kloroform süspansiyonlu stok çözeltilerinin miktarını hesaplayın. Her biri 10 ml'de 400 μM DOPC ve 80 μM Biotin-PE fosfolipidlerin nihai konsantrasyonlarını yapmak için, 629 μl 10 mg / ml DOPC ve 88 μl 10 mg / ml Biotin-PE'yi ayrı cam kromatografi tüplerine yerleştirerek başlayın.
NOT: DOPC ve Biotin-PE'nin kloroform süspanse edilmiş stok çözeltisini aktarırken cam Hamilton şırıngalarını ve cam kromatografi tüplerini temizleme solüsyonu (60 g potasyum hidroksit, KOH içeren 120 ml suya 1 L %95 etanol) ile temizlemek önemlidir.
- Kloroformu kimyasal başlıkta bir argon akışı ile kurutun. Kromatografi tüpünü parafilm ile kapatın.
- Yeni kurutulmuş lipozomları, kalan kloroformu çıkarmak için gece boyunca bir liyofilizatörde (O / N) yüksek bir vakuma tabi tutun. Aynı gün tamamlamak için 60-90 dakika kurutun.
- Liyofilizatör çalışırken, bir miktar seyreltme tamponu hazırlayın. Bu protokol için 25 mM Tris, pH 8.0'dan oluşan 25 ml hazırlayın; 150 mM NaCl; ve %2 (ağırlıkça) n-oktil-β-D-glukopiranozit (OG) deterjan. Önce ilk iki malzemeyi karıştırın, ardından kuru OG tozunu eklemeden önce oksijeni argonla değiştirin. Hazırlandıktan sonra, OG çözeltisini 0.2 mikron selüloz asetat membran ile süzün ve 4 ° C'de saklayın.
- Ek olarak, aynı konsantrasyonlarda, ancak OG olmadan 1 L Tris-salin tamponundan oluşan iki vidalı şişe hazırlayın. Her birinin altına damıtılmış suyla temizlenmiş manyetik bir karıştırma çubuğu yerleştirin. 6 litre daha Tris-salin tamponu hazırlayın. Argonlu tüm şişelerden oksijeni çıkarın ve bunları da 4 ° C'ye koyun.
- Liyofilizasyondan sonra, her birinden 4 mM'lik bir çözelti yapmak için kurutulmuş lipitleri Tris-salin OG tamponunda çözün. Örnek hacimleri takiben, DOPC tüpüne 2 ml ve Biotin-PE tüpüne 0.2 ml ekleyin.
- Biotin-PE lipidlerini DOPC lipidleri ile karıştırın. Bu, SLB'nin hareketliliğini artırır, çünkü birleştirilmiş biyotin fosfat kafa gruplarının akışkanlığını bozabilir. 80 μM Biotin-PE'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için, 0.2 ml 4 mM Biotin-PE ve 1 ml 4 mM DOPC'yi karıştırın. Ardından 8.8 ml Tris-salin OG tamponu ekleyin.
- 400 μM DOPC'lik bir nihai konsantrasyon için, 1 ml 4 mM DOPC'yi 9 ml Tris-salin OG ile karıştırın.
- Sonikatörü buzlu suyla doldurun. Seyreltilmiş fosfolipid içeren cam tüpü, bir yardımcı kelepçe kullanarak sonikatörün ortasına yerleştirin. Çözelti berraklaşana kadar seyreltilmiş fosfolipidi 10 dakika boyunca sonikasyon.
not: Sonikasyon ısı üreteceğinden, sıcaklığı düşük tutmak için sonikatör su banyosuna buz ekleyin.
- Havadaki oksijeni sıvının yerini almak için tüpleri argonla doldurun ve parafilm ile kapatın.
2. Lipozomların Diyalizi
- Rulodan her fosfolipid seyreltmesi için bir tane olmak üzere uygun uzunlukta (bu örnekte 40 cm) iki kuru diyaliz tüpü (Moleküler Ağırlık kesme: 12-14.000, çap: 6.4 mm) kesin.
- Boru bölümlerini, 200 ml damıtılmış suyu bir cam beherde 2 dakika bekleterek yeniden sulandırın.
- Bunu yüksek ayarda 5 dakika veya en azından su kaynayana kadar mikrodalgada pişirin.
- Her tüpün bir ucuna bir düğüm atın ve iç kısmı birkaç mililitre Tris-saline-OG tamponu ile durulayın. Daha sonra, içinde kalan tampon miktarını en aza indirmek için bu yıkama tamponunun mümkün olduğunca çoğunu titizlikle sıkın.
- Laminer bir akış başlığında, seyreltilmiş fosfolipidleri her bir tüpe ekleyin ve açık uçları, tüm havayı dışarı atacak şekilde küçük bir diyaliz tüpü kapağı ile sıkıştırın. Tam hava tahliyesi, "su hattının" altına kenetlenerek numunenin küçük bir hacminin feda edilmesini gerektirecektir.
- Numuneleri önceden hazırlanmış OG içermeyen Tris-salin tampon şişelerine daldırın. Yeniden kapatmadan önce şişedeki oksijeni argonla değiştirin ve 4°C'de O/N'yi karıştırmak için yerleştirin.
- Tüpü her 12 saatte bir en az 3 kez OG içermeyen yeni bir Tris-salin tamponu şişesine aktarın.
- Diyaliz lipidlerinin çıkarılmasından kısa bir süre önce, oksijenin yerini almak için her birini argonla doldurarak lipitleri alikot etmek için bir dizi küçük tüp hazırlayın.
- 36 saat sonra diyaliz şişelerini laminer akış başlığına alın ve diyaliz tüplerini şişelerden çıkarın. Islak akışı toplamak için elinizde bir tezgah bebek bezi veya beher bulundurun.
- Klipsin üzerindeki diyaliz tüpünü kesin, ardından klipsi çıkarın ve diyaliz lipid solüsyonunu pipet yoluyla buz üzerinde argon gazı ile doldurulmuş önceden hazırlanmış tüplerde 1 ml'lik alikotlara dikkatlice aktarın.
- Sulu lipozom çözeltisini ayırın ve her tüpteki oksijeni tekrar değiştirmek için argon akışını kullanın.
- Lipozomları 4°C'de saklayın. Dondurmayın.
3. İnsan NK Hücrelerinin İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi
- 15 ml periferik kan veya buffy ceketi 50 ml'lik konik bir tüpe alikot. Bu kanı 1:1 oranında %1 fetal sığır serumu (FBS) içeren fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltin.
- 10 ml'lik serolojik bir pipet ile tüpün dibine nazikçe 13 ml Ficoll ekleyin.
- Bu tüpü hızlandırıcı ve koparma ile veya en düşük ayarlarda 1.200 x g'de 20 dakika santrifüjleyin.
- Santrifüjlemeden sonra, periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) yüzen bulutlu beyaz orta katmanını toplamak için serolojik bir pipet kullanın ve her ikisi de en alt kırmızı kan hücresi tabakasının (RBC'ler) üzerinde bulunan berrak sarı bir üst tabaka ile daha bulanık soluk renkli bir alt tabaka arasındaki kesişim. NOT: PBMC'leri toplarken herhangi bir RBC toplamayın.
- Toplanan PBMC'leri 50 ml'lik yeni bir konik tüpe yerleştirin ve% 1 FBS içeren PBS ile kapasiteye seyreltin. Bu sefer fren ve gaz pedalı maksimumda 5 x g'da 300 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve% 1 FBS içeren 10 ml PBS'de hücreleri yeniden süspanse edin.
- Santrifüjleme sırasında hücreleri adım 3.6'daki ile aynı ayarlarda bir kez daha sayın.
- Süpernatanı bir kez daha atın ve hücreleri R10 ortamındaki hücreleri 10 milyon hücre / ml yoğunlukta yeniden süspanse edin.
- 5 ml'lik bir polistiren tüpte 30 milyon hücre alın ve üreticinin talimatlarını izleyerek manyetik bir ayırma kiti kullanarak NK hücrelerini izole edin. İzolasyonu takiben, hücreleri bir kez daha sayın ve R10 tam ortamında (% 88 Roswell Park Memorial Institute ortamı, RPMI;% 10 FBS;% 1 N-2-hidroksietilpiperazin-N-2-etan sülfonik asit, HEPES;% 1 sodyum piruvat) 500.000 hücre / ml yoğunlukta yeniden süspanse edin. Bir CO2 inkübatörde 37 ° C'de kültür yapın ve ortamı haftada 2-3 kez değiştirin.
4. Cam Destekli Düzlemsel Lipid Çift Tabakasının Montajı
- % 30 hidrojen peroksit ile sülfürik asit ile bir beherde 1: 3 oranında karıştırarak 100 ml piranha çözeltisi hazırlayın.
not: Her zaman uygun şekilde tasarlanmış bir kimyasal çeker ocakta sülfürik asit gibi zararlı maddelerle çalışın.
- Bu çözeltiye, 2 dikdörtgen # 1.5 lamel 20-30 dk.
boyunca piranha çözeltisine daldırın
not: Lamellerin pirana solüsyonu ile temizlenmesi esastır.
- Lameller temizlenirken 1 tüp önceden hazırlanmış 400 μM DOPC lipid ve 1 tüp önceden hazırlanmış 80 μM Biotin-PE lipid alın. Onları buz üzerinde argon tankına taşıyın.
- Oksijeni argonlu yeni bir mikrosantrifüj tüpünde değiştirin, ardından DOPC ve Biotin-PE'yi 1: 1 oranında bir araya getirin. Spesifik hacim, deneysel ihtiyaçlara göre değişecektir, ancak her biri en az 2 μl olmalıdır. Karışım tüpündeki oksijeni bir kez daha argon gazı ve ayrı reaktif tüpleri ile buzdolabına geri koymadan önce
boşaltın.
- Temizlik bittikten sonra, lamelleri damıtılmış suyla iyice durulayın. Lamelleri birkaç dakika kurumaya bırakın.
- Adım 5.4'te hazırlanan lipozom karışımından 1.5 μl'yi çekin ve tek bir damla halinde oda sürgüsünün şerit odalarından birine alın. Şerit başına 2 damla kullanımı tipiktir, ancak gerekli değildir.
- Kuru lamel damlacıkların üzerine hızlı ve verimli bir şekilde yerleştirin. Lamel yerleştirildikten sonra birleşmemeleri için damlaların yeterince aralıklı olduğundan emin olun. Ayrıca, damlaların oda duvarlarının kenarlarına dokunmadan dairesel ve iyi tanımlanmış kaldığından emin olun. Lamel ve kayma arasında su geçirmez bir sızdırmazlık sağlamak için her şeridin arasına ve çevresine sıkıca bastırın.
- Bir işaretleyici kalem kullanarak damlaların konumlarını işaretleyin.
- Çift tabakayı bloke etmek için hazneden 100 μl sulu %5 kazein geçirin. Akış odasında kabarcık olmadığından emin olmaya çalışın.
- Her şeride 333 ng / ml konsantrasyonda 100 μl streptavidin enjekte edin. Oda sıcaklığında (RT) 10-15 dakika inkübe edin. Daha sonra, fazla streptavidini çıkarmak için her şeritten 3 ml HEPES-Tamponlu Salin (HBS) /% 1 insan serum albümini (HSA) geçirerek yıkayın.
- Daha önce en etkili olduğu belirlenen protein konsantrasyonunda Alexa Fluor 568 gibi 100 μl biyotinile floresan etiketli anti-CD16 ekleyin. Karanlıkta 20-30 dakika inkübe edin. Her şeritten 3 ml HBS /% 1 HSA geçirerek tekrar yıkayın.
- Fazla streptavidini bağlamak ve böylece streptavidinin hücrelere spesifik olmayan bağlanma şansını ortadan kaldırmak için hazneden 25 nM'lik bir konsantrasyonda 100 μl D-biotin akıtın.
- NK hücrelerini sayın ve HBS /% 1 HSA'da 500.000 / ml konsantrasyonda yeniden süspanse edin.
- Hücreleri döndürürken, D-biotin'i şerit başına 3 ml HBS /% 1 HSA ile odadan yıkayın.
- NK hücrelerini eklemeden önce toplam iç yansıma floresan (TIRF) veya konfokal mikroskopi üzerinde foto ağartma sonrası floresan geri kazanımı (foto ağartma sonrası floresan geri kazanımı, FRAP) ile SLB üzerindeki ligandların hareketliliğini kontrol edin.
- Hücreler dönmeyi bitirdikten ve istenen konsantrasyonda yeniden süspanse edildikten sonra, her şeride 100 μl ekleyin.
- Hazneyi 30-60 dakika boyunca 37° %5 CO2 inkübatöre yerleştirin.
- Bu inkübasyon süresinden sonra, hücreleri 10-20 dakika boyunca RT'de% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. Paraformaldehiti çıkarmak için her şeritten 3 ml PBS geçirerek yıkayın.
- 400 μl bloke edici tampon ekleyin (PBS'de% 5 normal eşek serumu ve% 0.2 Triton X-100). RT'de 30 dakika inkübe edin.
- 200 μl seyreltilmiş floresan etiketli phalloidin (1 birim / ml etiketli phalloidin) ve floresan etiketli anti-perforin monoklonal antikor (500 ng / ml anti-perforin mAb) ekleyerek F-aktin ve perforini boyayın. RT'de 1 saat inkübe edin.
- 3 ml PBS çalıştırarak yıkayınız. Hazne görüntüleme için hazırdır.
5. NK Sinapsının Lipid Çift Tabakası Üzerinde STED Kullanılarak Görüntülenmesi
- Gerekli tüm donanım modüllerini açın.
- Görüntü analizi yazılımını başlatın. Hem rezonans taramayı hem de STED modüllerini etkinleştirin. Bu seçimleri yaptıktan sonra yazılımın başlaması için yaklaşık 3-5 dakika bekleyin.
- Ekranın üst kısmındaki "Yapılandırma" sekmesine tıklayın.
- "Laser Config"i seçin, ardından beyaz ışığı ve STED 592 nm lazerleri açın.
- 100x objektifi seçin ve uyarma lazer ışınını 592 nm tükenme lazeri ile hizalayın.
- "Lazer Yapılandırma" modülünü seçin, 592 tükenme lazerini kapatın ve 660 nm tükenme lazerini açın.
- Slaytı sahnenin üzerine, merceğin üzerine yerleştirin. Beyaz ışık lambasını ve oküler kullanarak sınırları belirlenmiş iki katmanlı bölgeye bağlı hücreleri odak noktasına getirin.
- Doğrudan "Yapılandırma" sekmesinin sağındaki "Edinme" sekmesine dönün.
- "Beyaz Işığa Geç" sekmesine tıklayın, ardından bu modülü açın ve uyarma lazer çizgisini uygun dalga boyuna sürükleyin.
- Mevcut olanlar listesinden istediğiniz dedektörü seçin, ardından algılama aralığını uygun dalga boyu aralığını kapsayacak şekilde ayarlayın.
not: Algılama aralığını ASLA doğrudan uyarma ışınının altına koymayın.
- Sol taraftaki araç çubuğunun altındaki Sıralı Tarama iletişim kutusunu açmak için sol taraftaki "Al" araç çubuğundaki "Sıralı" düğmesine tıklayın. Bu, kullanıcının her biri farklı bir renk için farklı bir uyarma ışınına sahip birden fazla dizi eklemesine olanak tanır. "Çerçeveler Arasında"ya tıklayın ve ardından 5.9 ve 5.10 adımlarında olduğu gibi her ek renk için uyarma frekansını, dedektörü ve algılama aralığını ayarlayın.
- Tüm ayarlar optimize edildikten sonra, satın alma işlemine başlamak için "Başlat" a basın.