Akış Sitometrik Analizi için Doğal Öldürücü Hücre Aracılı Sitotoksisite Testi Numune Hazırlama

Özet

Kaynak: McBride, J. E., et al. İnsan Tam Kanında Doğal Öldürücü Hücre Litik Aktivitesinin Sitometrik Analizi. J. Vis. Uzm. (2017).

Bu video, doğal öldürücü hücrelerin floresan lekeli hedef hücrelere karşı litik aktivitesini göstermektedir. Yöntem, ölü hücreleri boyayarak ve canlı ve ölü hedef hücreleri ölçmek için bir akış sitometresi kullanarak NK hücresinin neden olduğu sitotoksisite ölçümünü mümkün kılar.

Protokol

1. Kontrollerin Hazırlanması

1. Aşağıdakileri ayrı ve uygun şekilde etiketlenmiş 1.5 ml'lik tüplere aktarın:
   1. "Çift Pozitif" etiketli 1.5 mL tüpe yeniden süspanse edilmiş DiO etiketli K562 hücreleri içeren 500 μL taze IMDM ekleyin.
   2. "Yalnızca DiO" etiketli 1.5 mL tüpe yeniden süspanse edilmiş DiO etiketli K562 hücreleri içeren 500 μL taze IMDM ekleyin.
   3. "Yalnızca Propidium İyodür (PI)" etiketli 1.5 mL'lik tüpe yeniden askıya alınmış, etiketlenmemiş K562 hücreleri içeren 500 μL taze IMDM ekleyin.
2. Çift Pozitif ve yalnızca PI tüplerini 55 dakika boyunca 5 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
3. 5 dakika geçtikten sonra tüpleri çıkarın ve %70 etanol ile silin.
4. Çift Pozitif ve sadece PI 1.5 mL tüplere 10 L PI ekleyin.
5. Üç K562 hedef hücre kontrolünü de 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin.
6. 30 dakikalık inkübasyon sona erdikten sonra, üç K562 hedef hücre kontrolünü de 2 x g'da 163 dakika santrifüjleyin.
7. Hücre peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın.
8. Her kontrolü 20 μL taze IMDM hücre kültürü ortamı ile yeniden askıya alın ve optimum DiO sinyali için en az 30 dakika boyunca% 5 CO₂ içeren 37 ° C inkübatörde bırakın.
   not: Kontroller artık görüntüleme akış sitometresi aracılığıyla çalıştırılmaya hazırdır.

2. Sitotoksisite Testi Numune Hazırlama

1. Her numune/katılımcı için 1.5 mL'lik tüpleri buna göre hazırlayın ve etiketleyin.
2. Pipet, her tüpteki NK hücrelerinin ve DiO etiketli K562 hücrelerinin oranını istedi.
   NOT: Örneğin, K562 hedef hücrelerinin ve NK efektör hücrelerinin istenen oranı 1:5'tir.
3. 135 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
4. Hücre peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın.
5. NK-DiO etiketli K562 hücre karışımını, interlökin-2 (IL-2) ve 2-merkaptoetanol (2-ME) (eksik NK hücre kültürü ortamı) olmadan 500 μL NK hücre ortamında yeniden süspanse edin.
   NOT: Tamamlanmamış NK hücre kültürü ortamı, L-glutamin, ribonükleositler ve deoksiribonükleositler içermeyen sodyum bikarbonatlı Minimum Esansiyel Orta Kartal'dır.
6. Her tüpe 5 μL PI ekleyin.
7. 163 x g'da 2 dakika santrifüjleyin.
8. Hücreleri 37 ° C'de 2 saat inkübe edin.
9. 2 saatlik inkübasyondan sonra, 163 x g'da 2 dakika santrifüjleyin.
10. Hücre peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın.
11. 25 μL eksik NK hücre kültürü ortamında hücreleri yeniden süspanse edin.

3. Spontan ("S") Numunenin Hazırlanması

1. 500 μl DiO etiketli K562 hücresini (1 x 106 hücre / mL konsantrasyon) 1,5 mL'lik bir tüpe pipetleyin.
2. Her tüpe 10 μL PI ekleyin.
3. Santrifüj tüpünü 163 x g'da 2 dakika boyunca santrifüjleyin.
4. Hücreleri 37 ° C'de 2 saat inkübe edin.
5. 2 saatlik inkübasyondan sonra, 163 x g'da 2 dakika santrifüjleyin.
6. Hücre peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın.
7. 25 μl eksik alfa-minimum Esansiyel Ortam (α-MEM) hücre kültürü ortamında hücreleri yeniden süspanse edin.

4. Görüntüleme Akış Sitometresi ile Veri Toplama

1. Cihazı açmak için görüntüleme akış sitometresinin ön kapısının içindeki yeşil düğmeye basın.
2. Görüntüleme akış sitometresi ile ilişkili tüm bilgisayarları açın.
3. Görüntüleme akış sitometresi yazılımını başlatın.
4. Sistemi yıkamak ve numune hattını hazırlamak için "Başlangıç" düğmesine tıklayın.
5. "Başlatma" tamamlandığında, "Kalibrasyonlar" penceresini kapatın.
6. Kanal ata: Sol üst tarafta, atamak için her bir kanala tıklayın.
7. Sağ tarafta, 4 dağılım grafiği oluşturmak için dağılım grafiği düğmesine tıklayın: Raw Max Pixel _MC_6'a karşı Area_M06, Raw Max Pixel _MC_2'a karşı Area_M02, Raw Max Pixel _MC_5'a karşı Area_M05 ve FieldArea_M01'a karşı AspectRatio_M01.
8. Önce "Çift Pozitif" kontrolünü kullanarak numuneleri analiz etmeye başlayın.
   1. "Yükle" ye tıklayın.
   2. "Çift Pozitif" numuneyi içeren 1.5 ml'lik tüpü, Adım 1.4'ten 1.8'e kadar olan numune yükleyiciye yerleştirin.
   3. "Büyütme" sekmesi altında 40X hedefini seçin.
   4. 405 mW ve 642 mW lazerleri açın.
   5. "Brightfield" kanalını açın.
   6. "Yoğunluk Seç" i tıklayın.
   7. "Çift Pozitif" kontrol örneğine dayanarak, dedektörün aşırı yüklenmemesi için 405 mW lazer için istenen yoğunluğu belirleyin.
      not: Örneğin, bu deney için en uygun yoğunluk 11 mW olarak ayarlandı.
9. İstenen kurulum sağlandıktan sonra verileri elde edin.
   1. "Dosya Edinme" sekmesi altında, özel bir dosya adı metni girin. Veri dosyalarını kaydetmek için bir klasör seçin.
   2. "Topla" nın yanına alınacak hücre sayısını girin. Tipik olarak bu sayı 1.000 ila 10.000 arasında değişir.
   3. "Edin"
      üzerine tıklayın NOT: İstenen hücre sayısı elde edildiğinde, veri dosyası otomatik olarak önceden seçilen klasöre kaydedilir.
10. Alım tamamlandıktan sonra, bir sonraki kontrol örneğini yükleyin – yalnızca DiO kontrolü.
    1. "Yükle" ye tıklayın.
    2. 1.5 mL'lik tüpü "yalnızca DiO" ile yerleştirin.amps s yükleyiciye.
    3. "Büyütme" sekmesi altındaki 40X hedefini seçili bırakın.
    4. 405 mW lazeri açık bırakın.
    5. 642 mW lazeri ve "Brightfield" kanalını KAPATIN.
       NOT: Artık istenen kurulum sağlandığına göre, veriler elde edilebilir.
    6. "Dosya Edinme" sekmesi altında, özel bir dosya adı metni girin ve veri dosyalarını kaydetmek için bir klasör seçin. "Topla" nın yanına alınacak hücre sayısını girin. Genellikle bu sayı 1.000'dir.
    7. "Edin"
       üzerine tıklayın not: İstenen hücre sayısı elde edildiğinde, veri dosyası otomatik olarak önceden seçilen klasöre kaydedilir.
11. "Yalnızca PI" kontrol örneği için adım 4.10'u tekrarlayın. Deney örnekleri artık toplanmaya hazırdır.
12. "Spontan 'S' Örnekleri" de dahil olmak üzere kalan deneysel örnekleri aşağıdaki gibi ele alın:
    1. "Büyütme" sekmesi altındaki 40X hedefini seçili bırakın.
    2. 405 mW ve 642 mW lazerleri AÇIN.
    3. "Brightfield" kanalını AÇIN.
    4. "Yoğunluğu Ayarla" yı tıklayın.
    5. "Dosya Edinme" sekmesi altında, özel bir dosya adı metni girin ve veri dosyalarını kaydetmek için bir klasör seçin. Özel bir dosya adı metni girin.
    6. "Topla"nın yanına alınacak hücre sayısını girin.
    7. "Al" düğmesine tıklayın.
       not: İstenen hücre sayısı elde edildiğinde, veri dosyası otomatik olarak önceden seçilen klasöre kaydedilir.
13. Tüm deneysel numuneler için adım 4.12'yi tekrarlayın.
14. Tüm deneysel veriler ve dosyalar toplandıktan sonra, sistemi sterilize etmek için "Kapat" düğmesine tıklayın.

5. Görüntüleme Akış Sitometresi Örnek Analizi

1. Görüntüleme akış sitometresi analiz yazılımı uygulamasını açın.
2. "Dosya" bölümünün altında bir deney açın. RIF dosyası.
3. Tek bir renk kullanarak yeni bir matris oluşturun. RIF dosyaları (yalnızca DiO kontrolü ve yalnızca PI kontrolü, 4.10 ve 4.11 adımları sırasında oluşturulur) görüntüleme akış sitometresi yazılımındaki Kompanzasyon sekmesi altında "Yeni Bir Matris Oluştur" seçilerek.
   NOT: Yazılım, tek renk dosyalarının seçilmesini isteyecek ve kanal telafisi uygulamak için seçilecek bir matris dosyası (.ctm dosya uzantısı) oluşturmak için bunları birleştirecektir.
4. Yazılımın "yapı taşları" işlevini kullanarak nokta çizimleri oluşturun.
   1. Odaklanmış hücreleri geçit etmek için bir nokta grafiği (BrightFieldGradient_RMS ve frekans) oluşturun. Kapıyı "Odak" olarak adlandırın (Şekil 1A).
   2. "Odak" kapısını kullanarak, tekli hücreleri geçit etmek için Parlak Alan Alanı ve Parlak Alan En-Boy Oranı için bir nokta grafiği oluşturun. Kapıyı "Tek" olarak adlandırın (Şekil 1B).
   3. "Tek" kapıyı kullanarak, Intensity_MC_Ch02'e karşı Intensity_MC_Ch5'dan oluşan bir nokta grafiği oluşturun. Yalnızca DiO-pozitif hücreleri (hedefler, canlı) ve PI-DiO çift pozitif hücreleri (hedefler, ölü) tanımlamak ve kapılamak için bu grafiği kullanın (Şekil 1C).
      not: Adım 5.4.1, 5.4.2 ve 5.4.3'te açıklanan tüm grafikler, yazılımın "yapı taşları" işlevi kullanılarak oluşturulabilir.
5. Her kapının hücre numaralarına erişmek için nokta grafiğinin istatistik işlevine tıklayın.
6. Aşağıdaki formülü kullanarak spontan numune ve deneysel numunelerdeki ölü hedeflerin yüzdesini hesaplayın:
   Örnekteki ölü hedef yüzdesi = (#dead hedef x 100)/(#live hedef + #dead hedef)
7. Aşağıdaki formülü kullanarak sitotoksisiteyi hesaplayın:
   % sitotoksisite = [(Deneysel ölü-Spontan ölü)/(100-Spontan ölü)]x100

Sonuçlar

Şekil 1: Sitotoksik aktivite analizi için temsili histogramlar, dağılım grafikleri ve görüntüler. (A) odak hücre analizi. (B) tek hücre analizi. (C) hedef hücre boyama analizi. Tüm tespitler, her olaya eklenen resim kullanılarak yapılır. Buna, grafiklerdeki olaya tıklayarak analiz yazılımında erişilebilir. (D) bir apoptotik NK hücresi...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
K-562 lenfoblastları	ATCC (Uzay Servisi)	CCL-243
Iscove'un Modifiye Dulbecco'nun Medyası	ATCC (Uzay Servisi)	30-2005	Yüksek glikoz, L-Glutaminli, HEPES'li, Steril filtreli
Alfa Minimum Esansiyel ortam	ATCC (Uzay Servisi)	CRL-2407	Ribonükleositler ve deoksiribonükleositler içermez, ancak 2 mM L-glutamin ve 1,5 g/L sodyum bikarbonat içerir
Propridium İyodür Boyama Çözeltisi	BD Pharmingen	51-66211E
Vybranto DiO hücre etiketleme çözümü	Vybranto Belediyesi	V-22886
ImageStream X Mark II Görüntüleme Akış Sitometresi
Tam Kan CD56 Mikro Boncuklar, insan	Miltenyi Biyotec	130-090-875
ImageStream X Mark II Görüntüleme Akış Sitometresi	EMD Kırlangıç
Hız Boncukları	Amnis Şirketi	400030
INSPIRE Yazılımı	EMD Kırlangıç	Sürüm Mark II, Eylül 2013
Fikirler Uygulama Yazılımı	EMD Kırlangıç		Sürüm 6.1, Temmuz 2014

Serisi Serisi Serisi